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Biology

एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल जो ताजा-फ्रोज़न माउस हड्डियों से उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदाकरता है

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/60197
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Research, University of Veterinary Medicine Vienna

Summary

अस्थि कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। वर्तमान अध्ययन माउस फीमर वर्गों पर केंद्रित है। हालांकि, LCM प्रोटोकॉल यहाँ की सूचना के लिए किसी भी कठिन ऊतक की कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन किया जा सकता है.

Abstract

आरएनए उपज और अखंडता आरएनए विश्लेषण के लिए निर्णायक हैं. हालांकि, यह अक्सर तकनीकी रूप से पूरे लेजर पर कब्जा microdissection (LCM) प्रक्रिया भर में आरएनए अखंडता बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण है. चूंकि LCM अध्ययन सामग्री की कम मात्रा के साथ काम करते हैं, सीमित आरएनए पैदावार के बारे में चिंता भी महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, एक LCM प्रोटोकॉल हड्डी की कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था. दाग प्रोटोकॉल का प्रभाव, cryosections की मोटाई, microdisected ऊतक मात्रा, आरएनए निष्कर्षण किट, और LCM प्रणाली आरएनए उपज और माइक्रोविसेक्टेड हड्डी कोशिकाओं से प्राप्त अखंडता पर इस्तेमाल किया. आठ-m-thick जमे हुए हड्डी वर्गों एक चिपकने वाला फिल्म का उपयोग कर बनाया गया था और एक वाणिज्यिक LCM दाग के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल का उपयोग दाग. नमूना एक पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) झिल्ली और चिपकने वाला फिल्म के बीच sandwiched था. नमूना संग्रह और एक स्तंभ-आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है एक LCM प्रणाली पर्याप्त उपज के उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया। वर्तमान अध्ययन माउस फीमर वर्गों पर केंद्रित है। हालांकि, LCM प्रोटोकॉल यहाँ की सूचना दोनों शारीरिक स्थितियों और रोग प्रक्रियाओं में किसी भी कठिन ऊतक की कोशिकाओं में situ जीन अभिव्यक्ति में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

ऊतक विषमांगी और स्थानिक रूप से वितरित कोशिका प्रकारों से बने होते हैं। किसी दिए गए ऊतक में विभिन्न सेल प्रकार एक ही संकेत करने के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया कर सकते हैं. इसलिए, यह दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में विभिन्न सेल प्रकार की भूमिका के आकलन के लिए विशिष्ट सेल आबादी को अलग करने में सक्षम किया जा रहा आवश्यक है. लेजर पर कब्जा microdissection (LCM) जटिल ऊतकों से निर्दिष्ट कोशिकाओं को अलग करने और हटाने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और सटीक विधि प्रदान करताहै 1. LCM सिस्टम एक लेजर बीम की शक्ति का उपयोग करने के लिए संस्कृति में एंजाइमी प्रसंस्करण या विकास के लिए आवश्यकता के बिना हिस्टोलॉजिकल ऊतक वर्गों से ब्याज की कोशिकाओं को अलग. इसका मतलब यह है कि कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक ऊतक निवास में हैं, और विभिन्न कोशिकाओं के बीच स्थानिक संबंध सहित ऊतक वास्तुकला बनाए रखा है. दोनों पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं और अवशिष्ट ऊतक के Morphology अच्छी तरह से संरक्षित है, और कई ऊतक घटकों एक ही स्लाइड से क्रमिक नमूना किया जा सकता है. इसके बाद अलग-अलग कोशिकाओं का उपयोग उनके आरएनए, डीएनए, प्रोटीन या मेटाबोलाइट सामग्री2,3 के बाद के विश्लेषण के लिए किया जा सकताहै।

विभिन्न कोशिकाओं की जनसंख्या में जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, या विभिन्न उपचारों के बाद, बाद के विश्लेषण4,5के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा के एम.आर.एन.ए. प्राप्त करना आवश्यक है। डीएनए के विपरीत, आरएनए निर्धारण के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और जब उद्देश्य आरएनए का अध्ययन करने के लिए है तो जमे हुए ऊतक के उपयोग की सिफारिश की जाती है। चूंकि mRNAs जल्दी सर्वव्यापी ribonucleases (RNase) द्वारा अपमानित कर रहे हैं, नमूना हैंडलिंग और तैयारी और कमरे के तापमान पर नमूनों के भंडारण से बचने के दौरान कड़े RNase मुक्त शर्तों की आवश्यकता है. इसके अतिरिक्त, आरएनए अवक्रमण6को रोकने के लिए लंबे समय तक जलीय चरण के बिना तीव्र तकनीक महत्वपूर्ण है। आरएनए की उपज और सत्यनिष्ठा भी एलसीएम प्रक्रिया से प्रभावित हो सकती है औरएलसीएमप्रणाली का प्रयोग 7,8 किया जा सकताहै. वर्तमान में, विभिन्न ऑपरेटिंग सिद्धांतों के साथ चार LCM सिस्टम उपलब्ध हैं2. आरएनए निष्कर्षण की विधि भी महत्वपूर्ण हो सकती है क्योंकि विभिन्न आरएनए आइसोलेशन किटों का आरएनए मात्रा और गुणवत्ता7,8में महत्वपूर्ण अंतर के साथ परीक्षण किया गया है।

किसी भी ऊतक तैयारी विधि अच्छा आकृतिक विपरीत प्राप्त करने और आगे विश्लेषण के लिए आरएनए अखंडता को बनाए रखने के बीच एक संतुलन खोजने की आवश्यकता है. हड्डी से जमे हुए वर्गों की तैयारी के लिए, एक चिपकने वाला फिल्म विकसित किया गया था और लगातार9में सुधार हुआ. हड्डी वर्गों में कटौती और चिपकने वाला फिल्म पर सीधे दाग रहे हैं. यह चिपकने वाली फिल्म कई प्रकार के दाग लगाने पर लागू होती है, और एलसीएम9, 10 ,11,12,13, का उपयोग करके हड्डियों के क्रायओसेक्शन से ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, 14. शल्य चिकित्सा हटाने, embedding, ठंड, काटने और धुंधला सहित सभी चरणों कम से कम एक घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि अस्थिकोरकों , अस्थि अस्तर कोशिकाओं और ऑस्टियोक्लेस्ट जैसी कोशिकाओं की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सकती है9,10,11, 12,13,14. इस विधि तेजी से और सरल होने का लाभ है. अस्थि क्रायोसेक्शन उत्पन्न करने का एक वैकल्पिक तरीका टेप स्थानांतरण प्रणाली15का उपयोग करना है . हालांकि, बाद की तकनीक अधिक समय लेने वाली है और अतिरिक्त इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है, क्योंकि वर्गों को पराबैंगनी (यूवी) क्रॉस-लिंकिंग द्वारा पूर्वकोटेड झिल्ली स्लाइड पर चिपकने वाला टेप से स्थानांतरित करना पड़ता है। हालांकि टेप हस्तांतरण प्रणाली सफलतापूर्वक LCM16,17,18,19के साथ युग्मित किया गया है , यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पार से जुड़े कोटिंग एक पृष्ठभूमि पैटर्न बना सकते हैं कि सेल प्रकार पहचान20के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं .

आमतौर पर, आरएनए की केवल छोटी मात्रा में microdisected कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, और आरएनए गुणवत्ता और मात्रा अक्सर माइक्रो-केपिला इलेक्ट्रोफोरोसिस21द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं। एक कंप्यूटर प्रोग्राम आरएनए अखंडता संख्या (RIN) कहा जाता है आरएनए अर्क के लिए गुणवत्ता की एक सूचकांक आवंटित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 1ण्0 का RIN मान पूर्ण रूप से निम्नीकृत आरएनए को इंगित करता है, जबकि 10ण्0 का मान यह दर्शाता है कि आरएनए पूरी तरह अक्षुण्ण22है। आमतौर पर, 5 से अधिक अनुक्रमित आरएनए अध्ययन के लिए पर्याप्त माने जाते हैं। 5.0$10.0 के RIN मूल्य वाले नमूनों में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को एक दूसरे के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित करने की सूचना दी गई है23. हालांकि इस विधि की संवेदनशीलता अधिक है, के रूप में छोटे रूप में 50 pg/$L कुल आरएनए का पता लगाया जा सकता है, यह बहुत मुश्किल हो सकता है एक गुणवत्ता मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए यदि नमूने में आरएनए एकाग्रता बहुत कम है. इसलिए, आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, एलसीएम के बाद शेष ऊतक अनुभाग अक्सर स्लाइड24पर बफर पाइपिंग द्वारा आरएनए निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है।

हालांकि LCM विभिन्न जमे हुए ऊतकों पर बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, निकाले RNAs के RIN मूल्यों शायद ही कभी सूचित कर रहे हैं. इसके अलावा, माउस हड्डियों में आरएनए का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि को स्पष्ट करने के लिए कोई तुलनात्मक अध्ययन नहीं हैं। वर्तमान अध्ययन में, वयस्क माउस femurs से जमे हुए वर्गों नमूना तैयारी, LCM प्रोटोकॉल और आरएनए निष्कर्षण का अनुकूलन करने के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया. वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष रूप से LCM प्रणाली है कि नमूना संग्रह के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है के लिए अनुकूलित किया गया था.

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Protocol

चूहों से हड्डी ऊतक पशु देखभाल के लिए प्रचलित दिशा निर्देशों के अनुसार सख्त अनुसार इस्तेमाल किया गया था और सभी प्रयासों के लिए पशु पीड़ा को कम किया गया.

1. पशु और फ्रीज एम्बेडिंग

  1. निरंतर कमरे के तापमान की स्थिति में घर जानवरों (आरटी; 24 डिग्री सेल्सियस) और भोजन और पानी के लिए नि: शुल्क उपयोग के साथ एक 12 एच प्रकाश /
    नोट:इस अध्ययन में हड्डी के ऊतकों 3 महीने पुराने पुरुष जंगली प्रकार C57BL /6 चूहों से प्राप्त किए गए थे.
  2. नेक्रोप्सी पर, सामान्य संज्ञाहरण के तहत पेट वेना कैवा से बाहर निकलने वाले चूहों (केटामाइन/xylazine, 100/6 मिलीग्राम/kg इंट्रापेरिटोनल)।
    नोट: आरएनए गिरावट से बचने के लिए, RNase मुक्त उपकरणों और सामग्री का उपयोग करें, दस्ताने पहनते हैं और जल्दी से पूरे प्रयोग भर में आरटी पर नमूनों के भंडारण से बचने के काम करते हैं।
  3. पूरे femurs तेजी से निकालें, उन्हें आसपास के नरम ऊतकों के आसपास के स्केलपेल और कागज तौलिए का उपयोग कर साफ. embedding मोल्ड में इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक डालो, और embedding मोल्ड के नीचे में femur डाल दिया. तरल नाइट्रोजन में नमूने को स्नैप-फ्रीज करें। OCT आरटी और सफेद में पारदर्शी है जब जमे हुए.
  4. एक बार पूरी तरह से जमे हुए, पन्नी में नमूने लपेटो और उन्हें सूखी बर्फ पर -80 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण। आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

2. धारा तैयारी

  1. क्रायोस्टैट में तापमान को -19 डिग्री सेल्सियस और ब्लॉक धारक के तापमान को -17 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। 70% इथेनॉल का उपयोग कर cryostat इंटीरियर साफ करें। कठोर ऊतकों के लिए डिस्पोजेबल ब्लेड, कांच की स्लाइड और शांत करने के लिए cryostat में एक फिटिंग उपकरण रखें। उन्हें अनुभाग की अवधि के लिए cryostat के अंदर रखें.
  2. शुष्क बर्फ पर जमे हुए ऊतक ब्लॉक को क्रायोस्टैट में स्थानांतरित करें और इसे कम से कम 10 मिनट के लिए बराबर करने की अनुमति दें।
    नोट: क्रायोसेक्शनिंग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से -19 डिग्री सेल्सियस तक एक ब्लॉक के दोहराव वाले और अक्सर साइकिल चालन से बचें।
  3. OCT ब्लॉक को मोल्ड से बाहर पुश करने के लिए embedding मोल्ड के नीचे दबाएँ। ब्लॉक धारक को ब्लॉक का पालन करने के लिए पर्याप्त ओसीटी माध्यम लागू करें। OCT माध्यम पूरी तरह से जमे हुए है जब तक प्रतीक्षा करें।
  4. ऑब्जेक्ट होल्डर में ब्लॉक होल्डर रखें और इसे जगह पर कस दें। ब्लेड की स्थिति को समायोजित करें और नमूने को कवर करने के लिए ओसीटी को हटाने के लिए 15 डिग्री मीटर काटने की वृद्धि का उपयोग करके ब्लॉक को ट्रिम करें। यदि नमूना पहले काट दिया गया है और सतह हवा के संपर्क में, ब्लॉक से पहले 2 "3 ऊतक वर्गों को त्यागदें.
  5. 8 डिग्री मीटर वर्गों उत्पन्न करने के लिए cryostat समायोजित करें और 2 "3 cryosections कि खारिज कर दिया जाएगा कटौती (पहले कुछ आम तौर पर 8 डिग्री से अधिक मोटा हो जाएगा). ब्लॉक पर चिपकने वाला फिल्म रखें और ब्लॉक करने के लिए फिल्म का पालन करने के लिए एक फिटिंग उपकरण का उपयोग करें। धीरे धीरे और एक निरंतर गति से कटौती फिल्म द्वारा अनुभाग पकड़े बनाओ.
  6. नमूना के thawing से बचने के लिए फिल्म (नमूना का सामना करना पड़) तुरंत एक precooled ग्लास स्लाइड पर रखें (cryobar के भीतर cryobar पर) आसान धुंधला के लिए कांच स्लाइड करने के लिए फिल्म को ठीक करने के लिए टेप का प्रयोग करें। धुंधला प्रोटोकॉल के साथ तुरंत आगे बढ़ें।

3. तेजी से दाग प्रोटोकॉल

  1. 50 एमएल ट्यूबों में निम्नलिखित समाधानों में से 40 एमएल तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें: 95% इथेनॉल, RNase-मुक्त पानी, 100% इथेनॉल, 100% इथेनॉल और 100% xylene। बर्फ पर सभी चरणों (धुंधला को छोड़कर) प्रदर्शन. प्रत्येक प्रयोगात्मक दिन के लिए, सभी जलीय अभिकर्मकों RNase मुक्त पानी के साथ ताजा तैयार करते हैं।
    चेतावनी: गीलीन द्वारा नशा से बचने के लिए हुड में काम करें।
  2. 95% इथेनॉल में 30 एस के लिए इनक्यूबेट वर्गों, तो RNase मुक्त पानी में वर्गों 30 डुबकी OCT ध्यान से और पूरी तरह से जो LCM और बहाव अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटाने के लिए।
  3. वाणिज्यिक LCM जमे हुए अनुभाग दाग के 50 डिग्री सेल्सियस का वितरण(सामग्री की तालिका) खंड पर, आरटी पर 10 s के लिए इनक्यूबेट और शोषक ऊतक कागज पर स्लाइड के किनारे रखकर नाली. 100% इथेनॉल में 30 s rinsing द्वारा अतिरिक्त दाग निकालें.
  4. 30 s के लिए 100% इथेनॉल के साथ एक दूसरी ट्यूब में हड्डी वर्गों विसर्जित कर दिया और 30 s के लिए 100% xylene करने के लिए उन्हें हस्तांतरण।
  5. चिपकने वाला फिल्म रखो (नमूना ऊपर का सामना करना पड़ रहा है) एक समर्थन के रूप में सूखी कांच स्लाइड पर. ध्यान रखें कि फिल्म प्रभावित नहीं है और संभव के रूप में फ्लैट के रूप में रखा. नमूना पूरी तरह से सूखने की अनुमति न दें।
  6. उस पर एक पीईटी झिल्ली फ्रेम स्लाइड प्लेस. शीघ्र ही यह फिल्म के लिए संलग्न करने के लिए झिल्ली पर एक दस्ताने उंगली प्रेस. नमूना तो झिल्ली और चिपकने वाला फिल्म के बीच sandwiched है. चिपकने वाला फिल्म जोड़ या झुर्रियों नहीं होना चाहिए और फिल्म और झिल्ली के बीच कोई हवा बुलबुले नहीं होना चाहिए। LCM के साथ तुरंत आगे बढ़ें.

4. लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

  1. सतह decontaminant (सामग्री की तालिका)का उपयोग कर RNase से मंच और टोपी धारक साफ. स्लाइड धारक और कैप धारक में क्रमशः स्लाइड और कैप लोड करें।
  2. फोकस समायोजित करें और 1.25x उद्देश्य के साथ स्लाइड अवलोकन प्राप्त करें। 40x उद्देश्य को बदलें और ध्यान समायोजित करें. स्लाइड ओवरव्यू का उपयोग करके रुचि का क्षेत्र चुनें. लेजर पैरामीटर निम्नानुसार समायोजित करें: एपर्चर, 7; लेजर शक्ति, 60; गति, 5; नाड़ी आवृत्ति, 201; नमूना संतुलन, 20. प्रत्येक उद्देश्य के लिए इन पैरामीटर का अनुकूलन करें.
  3. लेजर नमूना में कटौती करने के लिए विफल रहता है, तो लेजर शक्ति में वृद्धि। वैकल्पिक रूप से, लेजर एक से अधिक बार लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, अपूर्ण कटौती के स्थानों के लिए लक्ष्य का निरीक्षण करें और चाल और कट विकल्प का उपयोग करके इन स्थानों में लाइन को फिर से तैयार किया। आगे की स्लाइड्स के विच्छेदन के लिए लेज़र सेटिंग्स सहेजें।
  4. अस्थिदोषके मानदंडों के आधार पर दूरस्थ ऊरु cancellous या cortical हड्डी में ऑस्टियोब्लास्ट्स, ऑस्टियोसाइट्स और हड्डी अस्तर कोशिकाओं का चयन करें। यूवी लेजर द्वारा क्षति को कम करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं से दूर लेजर पथ के लिए एक लाइन ड्रा करें। धुंधला करने के बाद कम से कम 1 एच के भीतर सभी microdissections प्रदर्शन.
  5. 0.5 एमएल ट्यूब की एक अलग टोपी में प्रत्येक सेल प्रकार लीजिए.
    नोट: तरल वसूली के बजाय सूखी कैप्चरिंग आरएनए गिरावट से बच सकती है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की टोपी में निहित बफर की बहुत छोटी मात्रा एलसीएम के दौरान या तो वाष्पित हो सकती है या क्रिस्टलीकरण (इसकी संरचना पर निर्भर करता है)।
  6. जहां लागू LCM के बाद संग्रह ट्यूब टोपी के अवलोकन द्वारा कब्जा सफलता की पुष्टि करें. आरएनए निष्कर्षण के साथ तुरंत आगे बढ़ें।

5. आरएनए निष्कर्षण

  1. संग्रह ट्यूब की टोपी में जेड-मेरकैप्टोथेनोल युक्त lysis बफर के 50 डिग्री सेल्सियस का वितरण करें और 1 मिनट के लिए टोपी में ऊपर और नीचे पाइप िंग द्वारा नमूना lyse। lysate नीचे स्पिन और lysis बफर के 300 $L जोड़ें जिसमें जेड-mercaptoethanol ट्यूब में युक्त है। यदि कई टोपियां जमा होने जा रही हैं, तो ध्यान रखें कि आरएनए निष्कर्षण किट(सामग्री तालिका)के लिए बफर की कुल मात्रा की सिफारिश की गई है।
    चेतावनी: आरएनए को गिरावट से बचाने के लिए जेड-मरकैप्टोएथेनोल जोड़ा जाना चाहिए, लेकिन इसे विषाक्त माना जाता है। सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें और हुड में काम करते हैं।
  2. इसके अलावा, प्रत्येक स्लाइड के लिए एक लेबल 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के साथ lysis बफर के 350 डिग्री एल युक्त तैयार करें - mercaptoethanol युक्त. आरएनए निकालने के लिए LCM के बाद शेष वर्गों का उपयोग करें। ध्यान से झिल्ली से फिल्म को अलग और धीरे धीरे अनुभाग पर lysis बफर पाइपिंग द्वारा नमूना lyse कई बार.
    नोट: lysis बफर की कुल राशि 350 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए। पाचन के लिए एक बार में यह सब का उपयोग न करें क्योंकि यह स्लाइड से प्रवाह होगा।
  3. सूखी बर्फ पर lysate नमूने रखो और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    नोट:     प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  4. आरटी पर lysates thaw. संग्रह ट्यूबों से 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में LCM-harvested कोशिकाओं से lysates स्थानांतरण. एक से अधिक टोपी नमूना फसल के लिए इस्तेमाल किया गया था, तो पूल कई lysates।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए निकालें। DNase के साथ कॉलम का इलाज मैं जीनोमिक डीएनए को दूर करने के लिए. एल्यूट आरएनए 14 डिग्री सेल्सियस आरएनसे-मुक्त जल के साथ, जिसके परिणामस्वरूप 12 डिग्री सेल्सियस एल्यूएट होता है। -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

6. आरएनए उपज और अखंडता का मापन

  1. गीला बर्फ पर Thaw आरएनए. सूक्ष्म-कैपिलरी इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग करके पृथक आरएनए की उपज और अखंडता को मापें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल आरएनए (1 $एल प्रति नमूना) को एक चिप(सामग्री तालिका)में लोड करें।

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Representative Results

एक LCM प्रोटोकॉल माउस femurs की हड्डी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था. अनुकूलित प्रोटोकॉल में, 8 m-थिक जमे हुए हड्डी वर्गों एक चिपकने वाला फिल्म पर काट रहे थे और एक वाणिज्यिक LCM जमे हुए अनुभाग दाग के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल का उपयोग दाग. नमूना पीईटी झिल्ली और चिपकने वाला फिल्म के बीच sandwiched था. माउस हड्डी कोशिकाओं नमूना संग्रह के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है कि एक LCM प्रणाली का उपयोग कर microdisected थे. एक स्तंभ आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि पर्याप्त उपज की एक उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पृथक आरएनए की उपज और अखंडता को सूक्ष्म-कैपिलरी इलेक्ट्रोफोरोसिस(चित्र 1)का उपयोग करके मापा गया था।

आरएनए गुणवत्ता और विभिन्न lysis प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त मात्रा में अंतर प्रतिनिधि जेल और इलेक्ट्रोफेरोग्राम में देखा जा सकता है. जब नमूना ऊपर और नीचे 1 मिनट के लिए टोपी में पाइपिंग द्वारा lysed किया गया था, यह 1 मिमी2 microdiscected हड्डी ऊतक (8 मिमी मोटी अनुभाग) से आरएनए के लगभग 8.5 एनजी को अलग करने के लिए संभव था। RIN मान 8.60 था (चित्र 2)

वैकल्पिक रूप से, LCM एक LCM प्रणाली है कि de-केंद्रित लेजर पल्स का उपयोग करता है, जो overhanging चिपकने वाला टोपी में सामग्री गुलेल का उपयोग किया गया था. आरएनए गुणवत्ता और मात्रा प्रतिनिधि जेल और इलेक्ट्रोफेरोग्राम में अनुमान लगाया जा सकता है। ताजा जमे हुए हड्डियों के लिए, यह 1 मिमी2 microdisected हड्डी ऊतक (8 मिमी मोटी अनुभाग) से आरएनए के लगभग 1.6 एनजी को अलग करने के लिए संभव था। RIN मान 1 था (चित्र 3) .

Figure 1
चित्रा 1: ताजा जमे हुए हड्डियों के लिए लेजर पर कब्जा microdissection प्रोटोकॉल का Flowchart. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि जेल (ऊपर) और आरएनए नमूनों के इलेक्ट्रोफेरोग्राम (नीचे)। LCM नमूना संग्रह के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है एक LCM प्रणाली का उपयोग किया गया था. आरएनए नमूने LCM-harvested ऊतक से प्राप्त किए गए (नमूने 1, 3, 5, 7, और 9) और इसी नियंत्रण वर्गों (नमूने 2, 4, 6, 8, और 10, क्रमशः). एक RNA नमूना दाग गया था, लेकिन LCM (नमूना 11) के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था जो नियंत्रण अनुभाग से प्राप्त किया गया था। 1 मिमी2 के कुल क्षेत्रफल microdisected किया गया था, और विभिन्न lysis प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया. नमूना 1: lysis बफर युक्त 350 डिग्री एल ट्यूब में जोड़ा गया था$-mercaptoethanol युक्त. टोपी ध्यान से बंद कर दिया गया था, और ट्यूब उलटा. LCM-harvested कोशिकाओं भंवर द्वारा lysed थे 1 मिनट, 10 मिनट के लिए आरटी पर incubating और भंवर 1 मिनट नमूना 3: lysis बफर युक्त 350 $L युक्त $-mercaptoethanol संग्रह ट्यूब में जोड़ा गया था, टोपी ध्यान से बंद कर दिया गया था, और ट्यूब उल्टे. एलसीएम-हैवटेदार कोशिकाओं को आरटी में 30 मिनट के लिए उल्टा संग्रह ट्यूबों द्वारा lysed किया गया था। नमूना 5: 50 डिग्री सेल्सियस युक्त lysis बफर के 50 डिग्री सेल्सियस संग्रह ट्यूब की टोपी में जोड़ा गया था और नमूना ऊपर और नीचे 1 मिनट के लिए टोपी में पाइपिंग द्वारा lysed किया गया था। lysate centrifuged था और lysis बफर के 300 $L युक्त $-mercaptoethanol ट्यूब में जोड़ा गया था. नमूना 7: 350 $L lysis बफर युक्त $-mercaptoethanol ट्यूब में जोड़ा गया था. टोपी ध्यान से बंद कर दिया गया था, और ट्यूब उलटा. LCM-harvested कोशिकाओं भंवर और कई बार उलटा द्वारा lysed थे. नमूना 9: lysis बफर युक्त 50 डिग्री एल $-mercaptoethanol संग्रह ट्यूब की टोपी में जोड़ा गया था, और नमूना टोपी में आरटी पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा lysed था। lysate centrifuged था, और lysis बफर युक्त 300 $L युक्त ]-mercaptoethanol ट्यूब में जोड़ा गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि जेल (ऊपर) और आरएनए नमूनों के इलेक्ट्रोफेरोग्राम (नीचे)। LCM एक LCM प्रणाली है कि de-केंद्रित लेजर पल्स का उपयोग करता है, जो अनुभाग के ऊपर तैनात चिपकने वाला टोपी में सामग्री गुलेल का उपयोग किया गया था. आरएनए नमूने LCM-harvested ऊतक (नमूना 5 और 6) और इसी नियंत्रण अनुभाग (नमूना 7) से प्राप्त किए गए थे। एक RNA नमूना दाग गया था, लेकिन LCM (नमूना 8) के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था जो नियंत्रण अनुभाग से प्राप्त किया गया था। 0.5 मिमी2 या 1 मिमी2 के कुल क्षेत्र microdisected किया गया था (नमूने 5 और 6, क्रमशः). संग्रह ट्यूब में $-mercaptoethanol युक्त lysis बफर के 350 डिग्री एल, टोपी सावधानी से बंद कर दिया गया था और ट्यूब उलटा. एलसीएम-harvested कोशिकाओं आरटी पर 30 मिनट के लिए उल्टा संग्रह ट्यूबों incubating द्वारा lysed थे. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

दोनों आरएनए गुणवत्ता और मात्रा इस तरह के ऊतक हेरफेर, LCM प्रक्रिया, और आरएनए निष्कर्षण के रूप में नमूना तैयारी के सभी चरणों में नकारात्मक प्रभावित हो सकता है। इसलिए, एक LCM प्रोटोकॉल बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था.

LCM के लिए, अधिकांश प्रयोगशालाओं वर्गों का उपयोग करें 7 [8 ]m मोटी2. मोटा वर्गों और अधिक सामग्री काटा जा करने के लिए अनुमति देगा। हालांकि, अगर वे बहुत मोटी हैं, यह सूक्ष्म संकल्प को कम कर सकता है और लेजर के माध्यम से कटौती करने में सक्षम नहीं हो सकता है. यह संभावना है कि इष्टतम ऊतक मोटाई LCM प्रणाली पर निर्भर करता है (और लेजर और स्लाइड प्रकार) इस्तेमाल किया, साथ ही सवाल8,25में ऊतक पर . वर्तमान अध्ययन में, विभिन्न मोटाई (4, 8 या 12 डिग्री मी) के क्रायोसेक्शन का परीक्षण किया गया; 8 m-थिक वर्गों LCM के लिए आदर्श होना पाया गया, जबकि 12 डिग्री हड्डी वर्गों लेजर के साथ कटौती करने के लिए और अधिक कठिन थे और 4 डिग्री वर्गों आरएनए की कम मात्रा में दिया.

अंतर्जात RNase गतिविधि विभिन्न ऊतकों के बीच भिन्न होता है. इसलिए, बहुत कम RNase गतिविधि के साथ ऊतकों के लिए विकसित धुंधला प्रोटोकॉल अन्य ऊतक प्रकार के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. परमाणु तेज लाल26 और cresyl बैंगनी24 आरएनए अखंडता के संरक्षण के मामले में सबसे अच्छा होने का सुझाव दिया गया. इसके अलावा, शराब आधारित तरीकों आरएनए अखंडता बनाए रखने के लिए जलीय दाग से बेहतर थे. हालांकि, वे अपरिवर्तनीय धुंधला तीव्रता27से पीड़ित थे। समय पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. एक तरफ, खोज और अनुभाग में ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आवश्यक समय, और LCM प्रदर्शन करने के लिए अक्सर अपेक्षाकृत लंबा है. दूसरी ओर, एलसीएम के लिए उपलब्ध समय सीमित है, क्योंकि कुछ मामलों में, 20% आरएनए गिरावट 30 मिनट28के बाद पहुंच गई थी। इसलिए, आरएनए को स्थिर करने के लिए विभिन्न तरीकों को लागू किया गया था, जैसे माइक्रोडिससेक्शन28के दौरान आर्गन फ्रलक्स के लिए वर्गों का प्रदर्शन, या बफर्ड अल्कोहल-आधारित क्रेसिल बैंगनी धुंधला का उपयोग करना और प्रयोगशाला में आर्द्रता स्तर को कम रखना। 27इसके अलावा, माइक्रोडिसेक्शन चरण के लिए अधिकतम 15 मिनट कासुझावदिया गया 2 . इस अध्ययन में, जमे हुए हड्डी वर्गों एक वाणिज्यिक LCM दाग के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल का उपयोग कर दाग थे, और यहां तक कि आरटी में 1 एच के बाद, RIN मूल्यों 8.3 से 9.1 में कमी आई. इसलिए, सभी microdissections धुंधला करने के बाद कम से कम 1 एच के भीतर प्रदर्शन किया गया. इसके अलावा, धुंधला करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया (जलीय अभिकर्मकों में या xylene कदम के बिना कम ऊष्मायन के साथ).। RIN मानों में कोई महत्वपूर्ण सुधार प्राप्त नहीं किया गया था।

LCM अध्ययन में, आरएनए निष्कर्षण विधियों के दो अलग अलग प्रकार की तुलना की गई है: एक चरण जुदाई विधि बनाम एक स्तंभ आधारित विधि. यह पाया गया कि स्तंभों के आधार पर आरएनए निष्कर्षण विधि से चरण पृथक्करण विधि8की तुलना में बेहतर आरएनए गुणवत्ता और अधिक उपज प्राप्त हुई . एक अन्य अध्ययन में, एक वाणिज्यिक किट है कि कम से कम पाचन समय और तापमान का उपयोग करता है (5 मिनट आरटी पर) एक आरएनए अलगाव किट है कि उच्च तापमान पर अब पाचन समय की जरूरत है की तुलना में बेहतर आरएनए गुणवत्ता में हुई (30 मिनट 42 डिग्री सेल्सियस पर)7. वर्तमान अध्ययन में, यह ताजा जमे हुए माउस हड्डियों और एक स्तंभ आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग कर LCM नमूनों से पर्याप्त एकाग्रता के उच्च गुणवत्ता आरएनए (RIN gt; 8) निकालने के लिए संभव था। अच्छी तरह से lysis (1 टोपी में मिनट pipeting) अच्छा आरएनए उपज के लिए आवश्यक है. LCM के बाद प्राप्त आरएनए उपज और अखंडता पर आरएनए निष्कर्षण विधि का प्रभाव निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार कई अलग आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर जांच की गई थी। तथापि, अनुकूलित प्रोटोकॉल में प्रयुक्त किट के साथ बेहतर गुणवत्ता वाले आरएनए और बढ़ी हुई मात्रा प्राप्त की गई थी। पायलट अध्ययन में, 1 मिमी2 अंतिम क्षेत्र के microdisected ऊतक क्षेत्रों में कटौती की गई थी, और यह लगभग 8.5 NG आरएनए को अलग करने के लिए संभव था 8-$m-thick हड्डी वर्गों का उपयोग कर (लगभग 800 pg/ आमतौर पर, ऑस्टियोब्लास्ट्स, ऑस्टियोसाइट्स, और हड्डी अस्तर कोशिकाओं को प्रति नमूने 2 "3 वर्गों में कब्जा कर लिया गया था।

विभिन्न LCM उपकरणों के बीच प्रत्यक्ष तुलना दुर्लभ हैं. एक अध्ययन में, दो आम LCM उपकरणों का परीक्षण किया गया, जो इस्तेमाल किया लेजर के प्रकार में अलग (यूवी और अवरक्त [आईआर], क्रमशः) और ऊतक पर कब्जा करने की विधि (संपीड़ित अलगाव टोपी बनाम पारदर्शी थर्माप्लास्टिक फिल्म के साथ लेपित टोपी, क्रमशः). यह पाया गया कि पतले-पतले जमे हुए ताजा जमे हुए माउस मस्तिष्क वर्गों के लिए, आईआर प्रणाली मामूली उच्च आरएनए गुणवत्ता7में हुई। वर्तमान अध्ययन में, दो LCM सिस्टम है कि संपर्क मुक्त नमूना संग्रह की अनुमति की तुलना में थे. एक प्रणाली में सूक्ष्मविक्षिप् त नमूना गुरुत्वाकर्षण द्वारा29से नीचे रखी टोपी में आता है। एक अन्य प्रणाली एक de-केंद्रित लेजर पल्स का उपयोग करता है, जो सामग्री को ओवरहैंगिंग कैप30में पहुंचा देता है। ताजा जमे हुए हड्डियों के लिए, उच्च आरएनए मात्रा और RIN मूल्यों प्राप्त किया गया जब गुरुत्वाकर्षण ऊतक पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, गुलेल प्रौद्योगिकी चिपकने वाली फिल्म, क्रायो-सेक्शन, और पीईटी झिल्ली से बना "सैंडविच" के साथ संगत नहीं है, पीईटी झिल्ली के अतिरिक्त वजन के कारण।

LCM ऊतक की सतह के लिए शारीरिक उपयोग की आवश्यकता है. इसलिए, बढ़ते और नमूने के कांच कवर, आकृति विज्ञान के बिगड़ा दृश्य के परिणाम के साथ, लागू नहीं है. इस सीमा को पार करने के लिए, एक तरल पदार्थ कवर माध्यम31विकसित किया गया था। वैकल्पिक रूप से, 10 डिग्री 15 डिग्री इथेनॉल के ऊतक अनुभाग पर सीधे जोड़ा जा सकता है, वाष्पीकरण2से पहले बेहतर आकृति विश्लेषण को सक्षम करने. वर्तमान अध्ययन में, जमे हुए हड्डी वर्गों एक चिपकने वाला फिल्म पर काट रहे थे और, इससे पहले कि नमूना पूरी तरह से सुखाने की अनुमति दी गई थी, यह पीईटी झिल्ली और फिल्म के बीच sandwiched था. इस "सैंडविच" विधि अच्छा morphological विपरीत दिया और विशिष्ट हड्डी कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से पहचान की गई.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकअपने उत्कृष्ट तकनीकी मदद के साथ ही उनके समर्थन के लिए Vetcore और पशु देखभाल स्टाफ के लिए Ute zeitz और निकोल Ginner धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma 63689-25ML-F
Absolute ethanol EMPLURA Merck Millipore 8,18,76,01,000
Adhesive film (LMD film) Section-Lab C-FL001
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies
Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit Agilent Technologies 5067-1513
Arcturus HistoGene Staining Solution Applied Biosystems 12241-05
Cryofilm fitting tool Section-Lab C-FT000
Cryostat Leica CM 1950 Leica Biosystems
Glass microscope slides, cut color frosted orange VWR Life Science 631-1559
Histology tissue molds PVC MEDITE 48-6302-00
LMD7 Laser Mikrodissektion System Leica Microsystems
Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL Leica Biosystems 14035843496
Nuclease-free water VWR Life Science E476-500ML
PET membrane slides 1.4 μm Molecular Machines & Industries GmbH 50102
RNase Away surface decontaminant Molecular BioProduct 7002
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Xylene VWR Life Science 2,89,73,363

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References

  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
  3. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  4. Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
  5. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  6. Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
  7. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
  8. Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
  9. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
  10. Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
  11. Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
  12. Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
  13. Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
  14. Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
  15. Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
  16. Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
  17. Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
  18. Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
  19. Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
  20. Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
  21. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
  22. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  23. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
  24. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
  25. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
  26. Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
  27. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  28. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  29. Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
  30. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
  31. Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).

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जीव विज्ञान अंक 151 लेजर कब्जा microdissection माउस हड्डियों आरएनए जीन अभिव्यक्ति आरएनए अखंडता संख्या
एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल जो ताजा-फ्रोज़न माउस हड्डियों से उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदाकरता है
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Marek, A., Schüler, C., Satué, M., Haigl, B., Erben, R. G. A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones. J. Vis. Exp. (151), e60197, doi:10.3791/60197 (2019).

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