Summary
פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.
Abstract
התשואה והיושרה של RNA הם המכריע עבור ניתוח RNA. עם זאת, היא לעתים קרובות מאתגרת לשמור על שלמות RNA לאורך כל לכידת הלייזר (LCM) ההליך. מאז מחקרים LCM עבודה עם כמויות נמוכות של חומר, חששות בנוגע לתשואות RNA מוגבל הם גם חשובים. לכן, פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. ההשפעה של הפרוטוקול כתמים, עובי של קריודורים, כמות רקמת מיקרו, הוצאת RNA ערכת, ו LCM מערכת בשימוש על התשואה RNA ויושרה המתקבל מתאי עצם מיקרוגזור הוערך. שמונה-μm-עבה מפרקי עצם קפואים נעשו באמצעות סרט דביק מוכתם באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי. המדגם היה דחוקה בין קרום פוליאתילן terאפרון (PET) ממברנה הסרט דבק. מערכת LCM המשתמשת בכוח הכבידה עבור אוסף דגימות ושיטת החילוץ של RNA המבוסס על עמודה שימשו כדי להשיג RNAs באיכות גבוהה של תשואה מספקת. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים באתרו בתאים של כל רקמה קשה הן בתנאים פיסיולוגיים ותהליכי המחלה.
Introduction
הרקמות מורכבת מסוגי תאים הטרוגנית ומבוזרים. סוגי תאים שונים ברקמה נתונה עלולים להגיב בצורה שונה לאותו אות. לכן, חיוני להיות מסוגל לבודד אוכלוסיות תאים מסוימות להערכת התפקיד של סוגי תאים שונים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. לכידת הלייזר (LCM) מציעה שיטה מהירה ומדויקת יחסית לבידוד והסרה של תאים שצוינו מרקמות מורכבות1. מערכות LCM להשתמש בכוחה של קרן לייזר כדי להפריד את התאים המעניינים סעיפים רקמות היסטולוגית ללא צורך בעיבוד אנזימטי או צמיחה בתרבות. משמעות הדבר היא כי התאים נמצאים בבית הגידול הטבעי שלהם רקמות, וכי ארכיטקטורת רקמות כולל הקשר המרחבי בין תאים שונים נשמרת. מורפולוגיה של שני התאים השבויים והרקמה השיורית נשמרת היטב, וניתן לדגום מספר רכיבי רקמה ברצף מאותה שקופית. תאים מבודדים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח עוקבות של RNA שלהם, DNA, חלבון או תוכן מטבוליט2,3.
כדי לנתח את הביטוי הגנטי באוכלוסיות תאים שונות, או לאחר טיפולים שונים, יש צורך להשיג mrnas של איכות וכמות מספקת עבור ניתוח הבא4,5. בניגוד ל-DNA, RNAs רגישים יותר קיבעון ואת השימוש ברקמה קפואה מומלץ כאשר המטרה היא ללמוד RNA. מאז mRNAs מושפל במהירות על ידי ribonucleases בכל מקום (RNase), מחמירים RNase-חינם תנאים במהלך טיפול הדגימה הכנה והימנעות אחסון של דגימות בטמפרטורת החדר נדרשים. בנוסף, טכניקות מהירות ללא כל שלבי מימית שלב ממושך הם חיוניים כדי למנוע השפלה RNA6. תשואה RNA ויושרה יכול להיות גם מושפע התהליך lcm ומערכת lcm בשימוש7,8. כיום, ארבעה מערכות LCM עם עקרונות הפעלה שונים זמינים2. השיטה של שאיבת rna יכול להיות גם חשוב, מאז ערכות בידוד rna שונים נבדקו עם הבדלים משמעותיים כמות rna ואיכות7,8.
כל שיטת הכנת רקמות דורש מציאת איזון בין קבלת ניגודיות מורפולוגית טובה ושמירה על שלמות RNA עבור ניתוחים נוספים. עבור הכנת חלקים קפואים מעצם, סרט דביק פותחה והשתפר ברציפות9. חתכי העצם חתוכים ומוכתמים ישירות על גבי הסרט הדביק. סרט דביק זה חל על סוגים רבים של כתמים, והוא יכול להיות מועסק כדי לבודד את התאים של העניין מ העצם קריודורים באמצעות lcm9,10,11,12,13, . ארבע עשרה כל השלבים כולל הסרת כירורגי, הטבעה, הקפאה, גזירה וכתמים ניתן להשלים תוך פחות משעה. חשוב מכך, תאים כגון אוסטאופתיים, תאים בטנה עצם, ו osteoclasts ניתן לזהות בבירור9,10,11,12,13,14. לשיטה זו יש את היתרון של היותו מהיר ופשוט. שיטה חלופית ליצירת מקטעי קריובון היא להשתמש במערכת העברת הקלטות15. עם זאת, הטכניקה האחרונה היא גוזלת זמן רב יותר ודורש מכשור נוסף, שכן הסעיפים צריכים להיות מועברים מסרט דביק על שקופיות קרום מצופה מראש על ידי אולטרה סגול (UV) הקישור החוצה. למרות שמערכת העברת הקלטות בוצעה בהצלחה בשילוב עם lcm16,17,18,19, יש לציין שציפוי המקושרות מקושרת יכול ליצור תבנית רקע ש יכול להתערב בזיהוי סוג תא20.
בדרך כלל, רק כמויות קטנות של RNA מופקים מתאי מיקרו, ו-RNA איכות וכמות מוערך לעתים קרובות על ידי אלקטרופורזה מיקרו-נימי21. תוכנית מחשב משמשת להקצאת אינדקס איכות לתמציות RNA שנקרא מספר שלמות RNA (RIN). ערך RIN של 1.0 מציין RNA מושפל לחלוטין, ואילו ערך של 10.0 עולה כי ה-RNA הוא שלם במלואו22. בדרך כלל, אינדקסים מעל 5 נחשבים מספיקים ללימודי RNA. ביטוי גנטי דפוסי בדגימות עם ערך RIN של 5.0-10.0 דווחו לתאם היטב אחד את השני23. למרות הרגישות של שיטה זו היא גבוהה, מאז מעט כמו 50 pg/μL של RNA סה כ ניתן לזהות, זה יכול להיות קשה מאוד להשיג הערכה איכות אם ריכוז RNA במדגם הוא נמוך מאוד. לכן, כדי להעריך את איכות ה-RNA, סעיף הרקמה שנותר לאחר LCM משמש לעתים קרובות כדי לחלץ RNA, על ידי מאגר מלטף על השקופית24.
למרות LCM נעשה שימוש נרחב על רקמות קפואות שונות, ערכי רין של RNAs מחולץ מדווחים לעתים נדירות. יתר על כן, אין מחקרים השוואתיים כדי להבהיר את השיטה המתאימה ביותר כדי ללמוד RNA בעצמות העכבר. במחקר הנוכחי, קטעים קפואים מתוך העכבר למבוגרים הורים שימשו כדי לייעל את ההכנה לדוגמה, פרוטוקול LCM ו-RNA חילוץ על מנת להשיג RNAs באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי היה אופטימיזציה במיוחד עבור מערכת LCM המשתמשת בכוח הכבידה עבור אוסף המדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמת העצם מעכברים שימש בהתאמה קפדנית עם הנחיות השוררים לטיפול בעלי חיים וכל המאמצים נעשו כדי למזער סבל בעלי חיים.
1. בעלי חיים והקפאת הטבעה
- חיות הבית בתנאים של טמפרטורת החדר קבוע (RT; 24 ° c) ו 12 h אור/12 h מחזור כהה עם גישה חופשית למזון ולמים.
הערה: רקמות העצם במחקר זה הושגו 3-חודש בן זכר פראי סוג C57BL/6 עכברים. - על נמק, לדימום עכברים מתוך הווריד הבטני הבטן תחת הרדמה כללית (קטמין/xylazine, 100/6 mg/ק"ג בתוך הצפק).
הערה: על מנת למנוע השפלה RNA, להשתמש RNase-מכשירים חינם וחומרים, ללבוש כפפות ולעבוד במהירות הימנעות אחסון של דגימות ב RT בכל הניסוי כולו. - מסירים את העצמות המקיפות במהירות, מנקים אותם מרקמות רכות באמצעות אזמל ומגבות נייר. יוצקים טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך עובש הטבעה, ולשים את עצם הירך לתוך החלק התחתון של עובש הטבעה. הקפא את הדגימות בחנקן נוזלי. OCT הוא שקוף ב-RT ולבן כאשר הוא קפוא.
- פעם קפוא לחלוטין, לעטוף את דגימות בנייר כסף ולהעביר אותם על קרח יבש עד-80 ° c. דגימות בחנויות ב-80 ° c עד לעיבוד נוסף.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
2. הכנת מדור
- הגדר את הטמפרטורה בהקפאה ל-19 ° צ' ומחזיק הבלוק ל-17 ° c. נגב את הפנים קריוסטט באמצעות 70% אתנול. הניחו את הלהב החד לרקמות הקשות, שקופיות הזכוכית והכלי המתאים לתוך הקריוסטט כדי להתקרר. שמור אותם בתוך הקריוסטט. למשך הזמן הקיים
- להעביר את בלוק הרקמה הקפואה על קרח יבש על קריוסטט ולאפשר את זה כדי שומן לפחות 10 דקות.
הערה: הימנע מהפשרה והרכיבה התכופים של בלוק אחד מ-80 ° c עד 19 ° c להקפאה. - לחץ על החלק התחתון של עובש הטבעה כדי לדחוף את הבלוק OCT מתוך העובש. החלת מספיק מדיום OCT על מחזיק הבלוק כדי לדבוק בבלוק אליו. המתן עד שבינונית OCT תהיה קפואה לגמרי.
- הצב את מחזיק הבלוק במחזיק האובייקט והדק אותו במקומו. להתאים את מיקום להב לקצץ את הבלוק באמצעות 15 יקרומטר חיתוך במרווחים כדי להסיר את OCT המכסה את המדגם. אם הדגימה נחתכה מוקדם יותר, והמשטח שנחשף לאוויר, מחק את שני מקטעי הרקמה הראשונים מהבלוק.
- להתאים את הקריוסטט כדי ליצור 8 מקטעים יקרומטר ולגזור 2-3 הקריודורים כי יימחקו (הראשונים בדרך כלל יהיה עבה יותר מ 8 יקרומטר). מניחים את הסרט דבק על הבלוק ולהשתמש בכלי הולם כדי לדבוק את הסרט לחסום. בצע את החיתוך לאט ובמהירות מתמדת המחזיקים את הקטע על ידי הסרט.
- מניחים את הסרט (מדגם הפונה כלפי מעלה) מיד על שקופית זכוכית מקורר (על הcryobar בתוך הקריוסטט) כדי למנוע את הפשרה של המדגם. השתמש בקלטת כדי לתקן את הסרט לשקופית זכוכית כדי להכתים יותר. . המשך מיד עם פרוטוקול הצביעת
3. פרוטוקול מכתים מהיר
- הכינו 40 mL של הפתרונות הבאים בצינורות 50 mL ולשים אותם על הקרח: 95% אתנול, RNase-מים ללא תשלום, 100% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילין. בצע את כל השלבים על הקרח (מלבד ההכתמים). עבור כל יום ניסיוני, להכין את כל הריאגנטים מימית טרי עם RNase-מים ללא תשלום.
זהירות: לעבוד בשכונה כדי למנוע שיכרון על ידי קסילן. - מקטעים דגירה עבור 30 s ב 95% אתנול, ואז לטבול סעיפים 30 s במים RNase-חינם כדי להסיר OCT בזהירות ולחלוטין אשר עלול להפריע ליישומים LCM ובמורד הזרם.
- לחלק 50 μL של כתם מסחרי LCM מקטע קפוא (טבלה של חומרים) על הסעיף, מודקות עבור 10 s ב RT ו לנקז אותו על ידי הצבת קצה השקופית על נייר טישו סופג. הסרת כתם עודף על ידי שטיפה 30 s ב 100% אתנול.
- מקטעי עצם לטבול בצינור השני עם 100% אתנול עבור 30 s ולהעביר אותם 100% קסילן עבור 30 s.
- שימו סרט דביק (מדגם הפונה כלפי מעלה) על שקופית זכוכית יבשה כתמיכה. לדאוג כי הסרט אינו מושפע וממוקם שטוח ככל האפשר. אל תאפשר את המדגם להתייבש לחלוטין.
- הצב מסגרת קרום המחמד שקופית על זה. לחץ לחיצה קצרה על הקרום כדי לצרף אותו לסרט. לאחר מכן הדגימה דחוקה בין הקרום לבין הסרט הדביק. סרט דביק לא צריך להיות מקופל או מקומט ולא צריך להיות בועות אוויר בין הסרט לבין קרום. המשיכו מיד עם ה-LCM.
4. לכידת לייזר מיקרודיסקציה
- נקה את הבמה ואת מחזיק הכובע מ RNase באמצעות משטח decontaminant (טבלת חומרים). טען את השקופית ואת האותיות הגדולות במחזיק השקופיות ובמחזיק הכיפה, בהתאמה.
- להתאים את המוקד ולרכוש סקירה שקופית עם מטרה 1.25 x. לשנות את המטרה 40x ולהתאים את המוקד. בחר את אזור העניין באמצעות מבט כולל על השקופית. להתאים את פרמטרי לייזר כדלקמן: מיפתח, 7; לייזר כוח, 60; מהירות, 5; תדר דופק, 201; . מאזן דגימות, 20 מטב פרמטרים אלה עבור כל יעד.
- אם הלייזר נכשל בחיתוך המדגם, הגדל את כוח הלייזר. לחילופין, ניתן להחיל את הלייזר יותר מפעם אחת. בנוסף, בדוק את היעד לנקודות של חתכים שלא הושלמו וצייר מחדש את הקו בנקודות אלה באמצעות המעבר ולחתוך את האפשרות. שמור הגדרות לייזר לניתוח של שקופיות עוקבות.
- בחר האוסטאופתית, האוסטאופתים ותאי העצם בטנה בעצם בציפוי הירך או העצמות הקורטיקלית מבוסס על קריטריונים מורפולוגיים. צייר קו עבור נתיב לייזר רחוק יותר מתאי היעד כדי למזער את הנזק על ידי לייזר UV. בצע את כל ההמיבתר בתוך פחות מ-1 לאחר ההכתמים.
- לאסוף כל סוג תא במכסה נפרד של צינור 0.5 mL.
הערה: לכידת יבש במקום שחזור נוזלי עשוי למנוע השפלה RNA. בנוסף, כמויות קטנות מאוד של מאגר הכלול כובע של צינור מיקרוצנטריפוגה יכול להתאדות או להתגבש (בהתאם הרכב שלה) במהלך LCM. - אשר את הצלחת הלכידה על-ידי התבוננות במכסה צינור הגבייה לאחר LCM כאשר הדבר ישים. המשיכו מיד עם חילוץ ה-RNA.
5. הפקת רנ א
- לחלק 50 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol לתוך כובע של צינור האוסף להוריד את המדגם על ידי ליטוף למעלה ולמטה בכובע עבור 1 דקות. ספין למטה למטה ולהוסיף 300 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol לתוך הצינור. אם מספר כובעים הולכים להיות מאגר, לדאוג כי הנפח הכולל של המאגר הוא כמומלץ עבור ערכת החילוץ RNA (טבלת חומרים).
זהירות: β-mercaptoethanol יש להוסיף כדי להגן על RNA מפני השפלה, אבל זה נחשב רעיל. תלבש בגדי הגנה וכפפות ותעבוד במכסה המנוע. - בנוסף, עבור כל שקופית להכין אחד מתויג 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם 350 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol. השתמש בסעיפים שנותרו לאחר LCM כדי לחלץ RNA. הפרד בזהירות את הסרט מהקרום ולאחר מכן המדגם על ידי ליטוף לאט ללטף את מאגר הליזה על הסעיף מספר פעמים.
הערה: הסכום הכולל של מאגר הליזה צריך להיות 350 μL. אין להשתמש בו מיד לצורך עיכול, כפי שהוא יזרום מהשקופית. -
הניחו את דגימות הליפוסט על הקרח היבש ואחסנו אותן ב-80 ° c.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - להפשיר את lysates ב RT. העברת lysates מתאים שנקטפו LCM מצינורות איסוף לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. אם השתמשו ביותר מכובע אחד כדי לקצור את המדגם, בריכה כמה lysates.
- לחלץ RNA לפי הוראות היצרן. התייחס לעמודות עם DNase I כדי להסיר דנ א גנומי. אליוט RNA עם 14 μL של מים ללא RNase, והתוצאה היא 12 μL הללויה. לאחסן RNA ב-80 ° c.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
6. מדידת תשואה ושלמות RNA
- הפשרת RNA על קרח רטוב. למדוד את התשואה ואת היושרה של RNA בודד באמצעות אלקטרופורזה מיקרו נימי. טען סה כ RNA (1 μL לכל מדגם) לשבב (טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם של העכבר femurs. בפרוטוקול אופטימיזציה, 8 μm-עבה מקטעים עצם קפואים נחתכו על סרט דביק מוכתם באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי קפוא המקטע. הדגימה הייתה דחוקה בין קרום חיית המחמד לבין הסרט הדביק. תאי עצם העכבר היו מיקרובאמצעות מערכת LCM המשתמשת הכבידה עבור אוסף לדוגמה. שיטת הוצאת RNA מבוססת עמודה שימש להשגת רנ א באיכות גבוהה של תשואה מספקת. התשואה והשלמות של RNA מבודדים נמדדה באמצעות אלקטרופורזה מיקרו-נימי (איור 1).
ההבדל באיכות RNA וכמות המתקבלים באמצעות פרוטוקולי פירוק שונים ניתן לראות ג'ל מייצג ו electropherograms. כאשר המדגם היה לאחר על ידי ליטוף למעלה ולמטה בכובע עבור 1 דקות, זה היה אפשרי לבודד כ 8.5 ng של RNA מ 1 מ"מ2 רקמת עצם מיקרו (8 μm-עבה מקטע). הערך RIN היה 8.60 (איור 2).
לחילופין, LCM בוצעה באמצעות מערכת LCM המשתמשת בפולס לייזר ממוקד, אשר מבלידאת החומר לתוך כובע דבק מוגזם. האיכות והכמות של RNA יכולים להיות מוערכים בג המייצג ובאלקטרו pheroגרמות. עבור עצמות קפואות טריות, זה היה אפשרי לבודד כ 1.6 ng של RNA מ 1 מ"מ2 מיקרו רקמת עצם (8 μm-עבה מקטע). ערך RIN היה 1 (איור 3).
איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול המיקרו-ניתוח לכידת לייזר עבור עצמות קפואות טריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ג'ל מייצג (למעלה) וelectropherograms (למטה) של דגימות RNA. LCM בוצעה באמצעות מערכת LCM המשתמשת בכוח הכבידה עבור אוסף המדגם. דגימות ה-RNA אוחזרו מרקמת LCM-שנקטפו (דגימות 1, 3, 5, 7, ו -9) ומקטעי בקרה מקבילים (דוגמאות 2, 4, 6, 8, ו -10, בהתאמה). דגם RNA אחד אוחזר ממקטע הבקרה שהיה מוכתם אך לא נעשה בו שימוש ב-LCM (לדוגמה 11). שטח כולל של 1 מ"מ2 היה מיקרוגזור, ופרוטוקולי פירוק שונים שימשו. לדוגמה 1:350 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol נוספו לתוך השפופרת. הכיפה נסגרה בקפידה, והצינור הפוך. תאים LCM-נקצרו היו על ידי vortexing 1 דקות, דגירה ב-RT עבור 10 דקות ו-vortexing 1 דקות. לדוגמה 3:350 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol נוספה לתוך צינור האוסף, הכובע היה סגור בקפידה, ואת הצינור הפוכה. תאים LCM-שנקטפו היו לאחר על ידי שפופרות אוסף הפוך למטה במשך 30 דקות ב RT. לדוגמה 5:50 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol נוספה לתוך כובע של צינור האוסף ואת המדגם היה לאחר ליטוף למעלה ולמטה בכובע עבור 1 דקות. Lysate היה ו-300 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol התווסף לתוך הצינור. לדוגמה 7:350 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol נוספה לתוך השפופרת. הכיפה נסגרה בקפידה, והצינור הפוך. תאים שנקטפו LCM היו לאחר ידי vortexing והיפוך מספר פעמים. לדוגמה 9:50 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol נוספה לתוך כובע של צינור האוסף, ואת המדגם היה לאחר על ידי דגירה עבור 5 דקות ב RT בכובע. ליפוסט היה centrifuged, ו-300 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol התווסף לצינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ג'ל מייצג (למעלה) ו electropherograms (למטה) של דגימות RNA. LCM בוצעה באמצעות מערכת LCM המשתמשת בפולס לייזר ממוקד, אשר מבליקות את החומר לתוך כובע דביק הממוקם מעל המקטע. דגימות ה-RNA אוחזרו מרקמת LCM שנאספה (דגימות 5 ו -6) ומקטע הבקרה המקביל (לדוגמה 7). דגם RNA אחד אוחזר ממקטע הבקרה שהיה מוכתם אך לא נעשה בו שימוש ב-LCM (לדוגמה 8). שטח כולל של 0.5 mm2 או 1 מ"מ2 היה microdissected (דגימות 5 ו-6, בהתאמה). 350 μL של מאגר הליזה המכיל β-mercaptoethanol נוספה לתוך צינור האוסף, הכובע היה סגור בקפידה את הצינור הפוכה. תאים LCM-שנקטפו היו לאחר על ידי המדורטינג צינורות אוסף הפוך למטה עבור 30 דקות ב-RT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הן איכות וכמות RNA יכול להיות מושפע באופן שלילי בכל שלבי ההכנה לדוגמה כגון מניפולציה רקמות, תהליך LCM, ו-RNA חילוץ. לכן, פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנטי הבאים.
עבור lcm, רוב המעבדות משתמשות בסעיפים 7 עד 8 יקרומטר עבה2. חלקים עבים יותר יאפשרו לקצור חומר נוסף. עם זאת, אם הם עבים מדי, זה יכול להפחית את הרזולוציה המיקרוסקופית ואת הלייזר אולי לא יוכל לחתוך. סביר להניח כי עובי רקמות אופטימלי תלוי במערכת lcm (ואת סוג הלייזר והשקופית) משמש, כמו גם על הרקמה בשאלה8,25. במחקר הנוכחי, הקריודורים בעוביים שונים (4, 8 או 12 μm) נבדקו; 8 יקרומטר-חלקים עבים נמצאו להיות אידיאלי עבור lcm, בעוד 12 מקטעי העצם יקרומטר היו קשים יותר לחתוך עם לייזר 4 מקטעים יקרומטר נתן כמויות נמוכות יותר של RNA.
פעילות RNase אנדוגניים משתנה בין רקמות שונות. לכן, מכתים פרוטוקולים שפותחו עבור רקמות עם פעילות RNase נמוך מאוד יכול להיות בלתי מתאים עבור סוגי רקמות אחרות. גרעיני מהיר אדום26 ו cresyl סגול24 הוצעו להיות הטובים ביותר במונחים של שמירה על שלמות RNA. בנוסף, שיטות המבוססות על אלכוהול היו מעולים על כתמי מים לשמירה על שלמות RNA. עם זאת, הם סבלו מפני כתמים מכתיבת27. הזמן הוא פרמטר חשוב לשקול. מצד אחד, הזמן הנדרש לחיפוש וזיהוי של תאי עניין בסעיף, ולביצוע LCM הוא לעתים קרובות יחסית ארוך. מצד שני, הזמן הזמין עבור LCM הוא מוגבל, מאז, במקרים מסוימים, 20% השפלה RNA הושגה לאחר 30 דקות28. לכן, שיטות שונות הוחלו על מנת לייצב את RNA, כגון חשיפה של סעיפים לשטף הארגון במהלך המיקרודיסקציה28, או שימוש באגירה מבוססת אלכוהול מובחנות סגול מכתים ושמירה על רמת הלחות במעבדה נמוכה 27. בנוסף, מקסימום של 15 דקות לשלב המיקרו-חיתוך הוצע2. במחקר זה, מקטעי עצם קפואים היו מוכתמים באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי, ואפילו אחרי 1 h ב RT, הערכים רין ירד מ 8.3 אל 9.1. לכן, כל המיקרובתר בוצעו בתוך פחות מ 1 h לאחר הצביעת. בנוסף, פרוטוקולים שונים עבור כתמים נבדקו (עם incubations קצר יותר ריאגנטים מימית או בלי הצעד קסילן). לא הושגה שיפור משמעותי בערכי RIN.
במחקרים LCM, שני סוגים שונים של שיטות חילוץ RNA הושוו: שיטת הפרדת הפאזה לעומת שיטה מבוססת-עמודה. נמצא כי שיטת החילוץ RNA המבוסס על עמודות הוביל לאיכות RNA טובה יותר ותשואה גבוהה יותר בהשוואה לשיטת הפרדת הפאזה8. במחקר אחר, ערכת מסחרית המשתמשת בזמן ובטמפרטורה מינימלי העיכול (5 דקות ב-RT) הביא לאיכות RNA מעולה בהשוואה לערכת בידוד RNA שדורש זמן עיכול ארוך יותר בטמפרטורה גבוהה יותר (30 דקות ב 42 ° c)7. במחקר הנוכחי, ניתן היה לחלץ באיכות גבוהה RNA (רין > 8) של ריכוז מספיק מדגימות LCM שימוש בעצמות העכבר טרי-קפוא ושיטת החילוץ של RNA המבוסס על עמודה. לפירוק יסודי (1 דקות ליטוף בכובע) חיוני לתשואה RNA טוב. ההשפעה של שיטת החילוץ RNA על תשואה ויושרה של RNA שהתקבלו לאחר LCM נחקר באמצעות מספר ערכות בידוד RNA שונות בהתאם להוראות היצרנים. עם זאת, RNAs באיכות טובה יותר וכמות מוגברת הושגו עם הערכה המשמשת בפרוטוקול הממוטב. במחקר פיילוט, מיקרו ברקמות אזורים של 1 מ"מ2 האזור הסופי נחתכו, וזה היה אפשרי לבודד כ 8.5 Ng של rnas באמצעות 8-μm-עובי העצם חלקים (כ 800 Pg/μl). בדרך כלל, האוסטאופיות, אוסטאופציטים ותאי עצם בטנה נלכדו ב -2-3 סעיפים לכל מדגם.
השוואות ישירות בין מכשירי LCM שונים הם נדירים. במחקר אחד, שני מכשירי LCM משותף נבדקו, אשר שונים בסוג של לייזר בשימוש (UV ואינפרא אדום [IR], בהתאמה) ואת השיטה של לכידת רקמות (כובע דבק לעומת כובעים מצופה בסרט תרמופלסטיים שקוף, בהתאמה). זה נמצא כי עבור חלקים במוח טרי קפוא מנות של העכבר, מערכת IR הביאה בצניעות גבוהה יותר באיכות RNA7. במחקר הנוכחי, שתי מערכות LCM המאפשרות איסוף ללא קשר מדגם הושוו. במערכת אחת, דגימת מיקרוגזור נופל על ידי כוח הכבידה לתוך כובע ממוקם ממש מתחת29. מערכת אחרת משתמשת פולס לייזר דה ממוקדת, אשר בליסטראות את החומר לתוך כובע תלוי יתר30. עבור העצמות קפוא טריים, כמויות RNA גבוהות יותר וערכי רין הושגו כאשר הכבידה שימש ללכידת רקמות. בנוסף, הטכנולוגיה catapulting אינו תואם את "סנדוויץ" המורכב של סרט דביק, מקטע ההקפאה, ואת קרום PET, בשל משקל נוסף של קרום PET.
LCM דורשת גישה פיזית למשטח הרקמה. לכן, הרכבה וכיסוי זכוכית של הדגימה היא בלתי ישימה, עם תוצאה של הדמיה לקויה של מורפולוגיה. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה בינונית כיסוי נוזלים31. לחילופין, 10 עד 15 μL של אתנול ניתן להוסיף ישירות על מקטע הרקמה, המאפשר ניתוח מורפולוגית טובה יותר לפני אידוי2. במחקר הנוכחי, קטעי עצם קפואים נחתכו על סרט דביק, לפני המדגם הורשה להתייבש לחלוטין, זה היה דחוקה בין קרום PET ואת הסרט. זו שיטת "כריך" נתן ניגודיות טובה מורפולוגית ותאים עצם ספציפיים זוהו בבירור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים ליוץ ' ולניקוללה גיסנר על העזרה הטכנית המצוינת שלהם, כמו גם על הצוות האחראי על הטיפול בבעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
