Summary
Ett protokoll för Lasers avskiljning av mikrodissektion (LCM) utvecklades för att erhålla tillräcklig mängd högkvalitativt RNA för gen uttrycks analys i benceller. Den aktuella studien fokuserar på mus lårbenet sektioner. Emellertid, den LCM protokoll som rapporteras här kan användas för att studera genuttryck i celler av någon hård vävnad.
Abstract
RNA-avkastning och integritet är avgörande för RNA-analys. Emellertid, det är ofta tekniskt utmanande att upprätthålla RNA integritet genom hela laser Capture microdissection (LCM) förfarande. Eftersom LCM-studierna fungerar med små mängder material är oron för begränsade RNA-avkastningar också viktig. Därför utvecklades ett LCM-protokoll för att erhålla tillräcklig mängd högkvalitativt RNA för gen uttrycks analys i benceller. Effekten av färgning protokoll, tjocklek kryosektioner, microdissekerade vävnad kvantitet, RNA extraktion kit, och LCM system som används på RNA avkastning och integritet som erhållits från microdissekerade benceller utvärderades. Åtta μm tjocka frysta ben sektioner gjordes med hjälp av en självhäftande film och färgas med hjälp av en snabb protokoll för en kommersiell LCM fläck. Provet var inklämt mellan ett polyetylentereftalat (PET) membran och självhäftande film. Ett LCM-system som använder gravitationen för provinsamling och en kolumnbaserad RNA-extraktionsmetod användes för att få en högkvalitativ RNAs med tillräcklig avkastning. Den aktuella studien fokuserar på mus lårbenet sektioner. Emellertid, det LCM-protokoll som rapporteras här kan användas för att studera in situ genuttryck i celler av någon hård vävnad i både fysiologiska förhållanden och sjukdomsprocesser.
Introduction
Vävnader består av heterogena och rumsligt distribuerade celltyper. Olika celltyper i en given vävnad kan reagera olika på samma signal. Därför är det viktigt att kunna isolera specifika cellpopulationer för att bedöma vilken roll olika celltyper har i både fysiologiska och patologiska förhållanden. Laser Capture microdissection (LCM) erbjuder en relativt snabb och exakt metod för att isolera och ta bort specificerade celler från komplexa vävnader1. LCM system använder kraften i en laserstråle för att separera cellerna av intresse från histologiska vävnad sektioner utan behov av enzymatisk bearbetning eller tillväxt i kulturen. Detta innebär att cellerna är i deras naturliga vävnad livsmiljö, och att vävnads arkitektur inklusive det rumsliga förhållandet mellan olika celler bevaras. Morfologin av både de fångade cellerna och den kvarvarande vävnaden är väl bevarad, och flera vävnads komponenter kan samplas sekventiellt från samma bild. Isolerade celler kan sedan användas för efterföljande analys av deras RNA, DNA, protein eller metabolit innehåll2,3.
För att kunna analysera genuttryck i olika cellpopulationer, eller efter olika behandlingar, är det nödvändigt att få mRNA av tillräcklig kvalitet och kvantitet för den efterföljande analysen4,5. I motsats till DNA är RNAs känsligare för fixering och användning av fryst vävnad rekommenderas när målet är att studera RNA. Eftersom mrnas snabbt bryts ned av allestädes närvarande ribonucleases (RNase), krävs stränga RNase-fria förhållanden under preparat hantering och beredning och att man undviker lagring av prover vid rumstemperatur. Dessutom är snabba tekniker utan några förlängda vattenfas steg avgörande för att förhindra RNA-nedbrytning6. RNA-avkastningen och integriteten kan också påverkas av LCM-processen och LCM-systemet används7,8. För närvarande finns fyra LCM-system med olika driftsprinciper tillgängliga2. Metoden för RNA-extraktion kan också vara viktig, eftersom olika RNA-isolerings satser har testats med signifikanta skillnader i RNA-mängd och kvalitet7,8.
Varje vävnads beredningsmetod kräver att man hittar en balans mellan att erhålla god morfologisk kontrast och bibehålla RNA-integriteten för ytterligare analyser. För beredning av frysta sektioner från ben, utvecklades en självhäftande film och förbättrades kontinuerligt9. Ben sektionerna skärs och färgas direkt på den självhäftande filmen. Denna självhäftande film är tillämplig på många typer av färgning, och kan användas för att isolera cellerna av intresse från benkryosektioner med hjälp av LCM9,10,11,12,13, 14. Alla steg inklusive kirurgiskt avlägsnande, inbäddning, frysning, skärning och färgning kan slutföras inom mindre än en timme. Viktigt är att celler som osteoblaster, ben foder celler och osteoklaster tydligt kan identifieras9,10,11,12,13,14. Denna metod har fördelen av att vara snabb och enkel. En alternativ metod för att skapa benkryosektioner är att använda band överföringssystemet15. Men den senare tekniken är mer tidskrävande och kräver ytterligare instrumentering, eftersom avsnitten måste överföras från den självhäftande tejpen på förbelagts membran diabilder med ultraviolett (UV) cross-linking. Även om bandet överföringssystemet har framgångsrikt i kombination med LCM16,17,18,19, bör det noteras att tvärbunden beläggning kan skapa ett bakgrundsmönster som kan störa cell typs identifieringen20.
Typiskt, endast små mängder av RNA utvinns ur microdissekerade celler, och RNA kvalitet och kvantitet bedöms ofta av mikro-kapillär elektrofores21. Ett datorprogram används för att tilldela ett index av kvalitet till RNA-extrakt som kallas RNA Integrity Number (RIN). Ett RIN-värde på 1,0 indikerar helt försämrad RNA, medan värdet 10,0 antyder att RNA är helt intakt22. Vanligtvis, index över 5 anses tillräckliga för RNA-studier. Gen uttrycksmönster i prover med ett RIN-värde på 5,0 − 10,0 har rapporterats korrelera väl med varandra23. Även om känsligheten hos denna metod är hög, eftersom så lite som 50 PG/μL av totalt RNA kan upptäckas, kan det vara mycket svårt att få en kvalitetsbedömning om RNA-koncentrationen i provet är mycket låg. Därför, för att bedöma RNA-kvalitet, vävnads sektionen kvar efter LCM används ofta för att extrahera RNA, genom pipettering buffert på bild24.
Även om LCM har använts i stor utsträckning på olika frysta vävnader, är RIN värden av extraherade RNAs sällan rapporteras. Vidare finns det inga jämförande studier för att klargöra den lämpligaste metoden för att studera RNA i mus benen. I den föreliggande studien användes frysta sektioner från femurer för vuxna möss för att optimera provpreparering, LCM-protokoll och RNA-extraktion för att få högkvalitativa RNAs. Det nuvarande protokollet har optimerats särskilt för LCM-systemet som använder gravitationen för provinsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Benvävnad från möss användes i strikt överensstämmelse med gällande riktlinjer för djuromsorg och alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande.
1. djur och frys inbäddning
- Husdjur i förhållanden med konstant rumstemperatur (RT; 24 ° c) och en 12 h ljus/12 h mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
Anmärkning: benvävnad i denna studie erhölls från 3-månaders gammal manlig vild typ C57BL/6 möss. - Vid Necropsy, exsanguinate möss från buken Vena Cava under narkos (ketamin/xylazin, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
Anmärkning: För att undvika RNA-nedbrytning, Använd RNase-fria instrument och material, Använd handskar och arbeta snabbt undvika lagring av prover vid RT genom hela experimentet. - Ta bort hela femurer snabbt, rengör dem av omgivande mjukdelar med skalpell och pappershanddukar. Häll optimal skärtemperatur (OCT) förening i inbäddning mögel, och sätta lårbenet i botten av inbäddning mögel. Snap-frys proverna i flytande kväve. OCT är transparent vid RT och vit när fryst.
- När den är helt fryst, Linda proverna i folie och överför dem på torris till-80 ° c. Förvara proverna vid-80 ° c till vidare bearbetning.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
2. avsnitt beredning
- Ställ in temperaturen i kryostaten till-19 ° c och på block hållaren till-17 ° c. Torka av kryostatinteriören med 70% etanol. Placera engångsbladet för hårda vävnader, glas rutschbanorna och ett passande verktyg i kryostaten för att kyla. Förvara dem i kryostaten under hela snittningen.
- Överför det frysta vävnads blocket på torris till kryostaten och låt det jämvikt i minst 10 min.
Anmärkning: Undvik upprepad upptinning och frekvent cykling av ett block från-80 ° c till-19 ° c för kryosnittning. - Tryck på botten av inbäddning mögel att driva OCT blocket ur mögel. Applicera tillräckligt med OCT medium till block hållaren för att fästa blocket på den. Vänta tills ULT mediet är helt fryst.
- Placera block hållaren i objekt hållaren och dra åt den på plats. Justera bladets position och trimma blocket med 15 μm skärsteg för att ta bort det ULT som täcker provet. Om provet har styckats tidigare och ytan utsätts för luft, kassera de första 2 − 3 vävnads sektionerna från blocket.
- Justera kryostaten för att generera 8 μm sektioner och skär 2 − 3 kryosektioner som kommer att kasseras (de första kommer normalt att vara tjockare än 8 μm). Placera den självhäftande filmen på blocket och använda ett passande verktyg för att fästa filmen på blocket. Gör snittet långsamt och med en konstant hastighet håller sektionen av filmen.
- Placera filmen (provet vänd uppåt) omedelbart på en förfuktad glas rutschbana (på cryobar i kryostaten) för att undvika upptinning av provet. Använd tejp för att fixera filmen till glas bilden för lättare färgning. Fortsätt omedelbart med infärgnings protokollet.
3. snabb infärgnings protokoll
- Bered 40 mL av följande lösningar i 50 mL-rör och Lägg dem på is: 95% etanol, RNase-fritt vatten, 100% etanol, 100% etanol och 100% xylen. Utför alla steg på isen (förutom färgning). Förbered alla vattenbaserade reagenser för varje experimentell dag med Rase-fritt vatten.
Försiktighet: Arbeta i huven för att undvika berusning av xylen. - Inkubera sektioner för 30 s i 95% etanol, sedan doppa avsnitten 30 s i RNase-fritt vatten för att avlägsna OCT noggrant och fullständigt som kan störa LCM och nedströms applikationer.
- Fördela 50 μL kommersiellt LCM fryst snitt fläcken (tabell över material) på sektionen, inkubera i 10 s vid RT och dränera den genom att placera kanten av bilden på absorberande mjukpapper. Ta bort överflödig fläck genom att skölja 30 s i 100% etanol.
- Sänk ned ben sektionerna i ett andra rör med 100% etanol i 30 s och överför dem till 100% xylen i 30 sekunder.
- Sätt självhäftande film (prov vänd uppåt) på torrt glas Slide som ett stöd. Var försiktig så att filmen inte påverkas och placeras så plant som möjligt. Låt inte provet torka helt.
- Placera ett husdjur membran ram glida på den. Kort tryck på ett handskar finger på membranet för att fästa den på filmen. Provet är sedan inklämt mellan membranet och den självhäftande filmen. Den självhäftande filmen ska inte vikas eller skrynkliga och det ska inte finnas några luftbubblor mellan filmen och membranet. Fortsätt omedelbart med LCM.
4. mikrodissektion för laserinfångning
- Rengör scenen och locket hållaren från RNase med hjälp av ytdekontaminant (tabell över material). Fyll på bilden och locken i bildhållaren respektive locket.
- Justera fokus och hämta bild översikt med 1,25 x mål. Ändra till 40x mål och justera fokus. Välj intresseområde med hjälp av bildöversikten. Justera laser parametrarna enligt följande: bländare, 7; lasereffekt, 60; hastighet, 5; pulsfrekvens, 201; prov balans, 20. Optimera dessa parametrar för varje mål.
- Om lasern inte skär provet, öka lasereffekten. Alternativt kan lasern appliceras mer än en gång. Dessutom inspektera målet för fläckar av ofullständiga nedskärningar och åter dras linjen i dessa fläckar med flytta och klippa alternativ. Spara laser inställningar för dissektion av efterföljande bilder.
- Välj osteoblaster, osteocyter och ben foder celler i distala femorala spongiösa eller kortikala ben baserat på morfologiska kriterier. Rita en linje för laser väg längre bort från målcellerna för att minimera skadorna av UV-laser. Utför alla mikrodissektioner inom mindre än 1 h efter färgning.
- Samla varje celltyp i ett separat lock av en 0,5 mL tub.
Anmärkning: Torr fångst istället för vätske återhämtning kan undvika RNA-nedbrytning. Dessutom kan mycket små volymer av buffert som finns i locket av mikrocentrifug röret antingen avdungra eller kristallisera (beroende på dess sammansättning) under LCM. - Bekräfta fånga framgång genom observation av samlingen röret locket efter LCM i tillämpliga fall. Fortsätt omedelbart med RNA-extraktionen.
5. RNA-extraktion
- Fördela 50 μL av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol i locket på samlingsröret och lyse provet genom att Pipettera upp och ner i locket i 1 min. snurra ner lysatet och tillsätt 300 μL av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol i röret. Om flera mössor kommer att slås samman, var noga med att den totala volymen av bufferten är som rekommenderas för RNA Extraction Kit (tabell över material).
Varning: β-merkaptoetanol måste tillsättas för att skydda RNA från nedbrytning, men det anses giftigt. Använd skyddande kläder och handskar och arbeta i huven. - Dessutom, för varje bild förbereda en märkt 1,5 mL microcentrifug rör med 350 μL av lysis buffert som innehåller β-merkaptoetanol. Använd de sektioner som återstår efter LCM för att extrahera RNA. Separera försiktigt filmen från membranet och lysera provet genom att långsamt Pipettera lyseringsbufferten på avsnittet flera gånger.
Anmärkning: Totala mängden lyseringsbuffert ska vara 350 μL. Använd inte allt det på en gång för matsmältningen som det kommer att flöda bort bilden. -
Lägg lysatproverna på torris och förvara dem vid-80 ° c.
Obs: protokollet kan pausas här. - Tina lysaterna vid RT. överför celllysat från LCM-skördade celler från insamlings rören till 1,5 ml-mikrocentrifugrör. Om mer än ett tak användes för att skörda provet, pool flera Lysates.
- Extrahera RNA enligt tillverkarens anvisningar. Behandla kolonner med DNase I för att avlägsna genomiskt DNA. Elute RNA med 14 μL RNase-fritt vatten, vilket resulterar i en 12 μL eluat. Förvara RNA vid-80 ° c.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
6. mätning av RNA-avkastning och-integritet
- Tina RNA på våt is. Mät avkastningen och integriteten hos isolerat RNA med hjälp av mikrokapillärelektrofores. Fyll på totalt RNA (1 μL per prov) i ett chip (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett LCM-protokoll utvecklades för att erhålla tillräcklig mängd högkvalitativt RNA för gen uttrycks analys i benceller från mufemurer. I det optimerade protokollet, 8 μm-tjocka frysta ben sektioner klipptes på en självhäftande film och färgas med hjälp av en snabb protokoll för en kommersiell LCM fryst avsnitt fläcken. Provet var inklämt mellan PET-membranet och den självhäftande filmen. Mus benceller var microdissekeras med hjälp av ett LCM-system som använder allvar för provinsamling. En kolumnbaserad RNA-extraktionsmetod användes för att erhålla ett högkvalitativt RNA med tillräcklig avkastning. Avkastningen och integriteten hos isolerat RNA mättes med hjälp av mikrokapillärelektrofores (figur 1).
Skillnaden i RNA-kvalitet och kvantitet som erhålls med hjälp av olika Lys-protokoll kan ses i den representativa gelen och electropherograms. När provet lyserades genom pipettering upp och ner i locket i 1 min, var det möjligt att isolera cirka 8,5 ng av RNA från 1 mm2 mikrodissekerad benvävnad (8 μm-tjock sektion). Värde var 8,60 (figur 2).
Alternativt, LCM utfördes med hjälp av ett LCM-system som använder de-fokuserad laserpuls, som katapulter materialet i den överhängande självhäftande locket. RNA-kvalitet och-mängd kan uppskattas i den representativa gelen och electropherograms. För färska frysta ben var det möjligt att isolera cirka 1,6 ng av RNA från 1 mm2 mikrodissekerade benvävnad (8 μm-tjock sektion). RIN-värdet var 1 (figur 3).
Figur 1: flödesschema med laserinfångnings-microdissection-protokoll för färskfrysta ben. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ gel (topp) och elektropherogram (botten) av RNA-prover. LCM utfördes med ett LCM-system som använder gravitationen för provinsamling. RNA-prover hämtades från LCM-skördad vävnad (prov 1, 3, 5, 7 och 9) och motsvarande kontroll sektioner (prov 2, 4, 6, 8 respektive 10). Ett RNA-prov hämtades från kontroll sektionen som var fläckig men inte användes för LCM (prov 11). En total yta på 1 mm2 var mikrodissekeras och olika Lys-protokoll användes. Provet 1:350 μL av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol sattes in i röret. Locket stängdes försiktigt, och röret inverterad. LCM-skördade celler var lyserat av vortexa 1 min, inkuberande vid RT för 10 min och vortexa 1 min. provet 3:350 μl av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol sattes in i uppsamlings röret, locket stängdes noggrant och röret inverteras. LCM-skördade celler var lyserade genom inkuberande samlingsrör upp och ned i 30 min vid RT. prov 5:50 μL av lyseringsbufferten innehållande β-merkaptoetanol lades in i locket på samlingsröret och provet lyserades genom pipettering upp och ner i locket under 1 min. Lysatet centrifugerades och 300 μL av lyseringsbufferten som innehöll β-merkaptoetanol sattes in i röret. Provet 7:350 μL av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol sattes in i röret. Locket stängdes försiktigt, och röret inverterad. LCM-skördade celler var lyserat av vortexa och Invertera flera gånger. Provet 9:50 μL av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol lades in i locket på samlingsröret, och provet lyserades genom inkubation i 5 minuter vid RT i locket. Lysatet centrifugerades och 300 μL av lyseringsbufferten som innehöll β-merkaptoetanol lades till i röret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativ gel (topp) och elektropherogram (botten) av RNA-prover. LCM utfördes med ett LCM-system som använder de-fokuserad laserpuls, som katapulter materialet i den självhäftande locket placerad ovanför sektionen. RNA-prover hämtades från LCM-skördad vävnad (prov 5 och 6) och motsvarande kontroll sektion (prov 7). Ett RNA-prov hämtades från kontroll sektionen som var fläckig men inte användes för LCM (prov 8). En total yta på 0,5 mm2 eller 1 mm2 var mikrodissekeras (prov 5 respektive 6). 350 μL av lyseringsbufferten som innehåller β-merkaptoetanol sattes in i uppsamlings röret, locket stängdes noggrant och röret inverterad. LCM-skördade celler var lyserade av inkuberande samlingsrör upp och ner för 30 min vid RT. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både RNA-kvalitet och-mängd kan påverkas negativt i alla stadier av prov preparationen, såsom vävnads manipulation, LCM-process och RNA-extraktion. Därför utvecklades ett LCM-protokoll för att erhålla tillräckligt mycket högkvalitativt RNA för efterföljande gen uttrycks analys.
För LCM använder de flesta laboratorier avsnitt 7 − 8 μm tjock2. Tjockare sektioner skulle göra det möjligt att skörda mer material. Men om de är för tjocka, kan detta minska mikroskopisk upplösning och lasern kanske inte kan skära igenom. Det är troligt att optimal vävnad tjocklek beror på LCM systemet (och laser och Slide typ) som används, samt på vävnaden i fråga8,25. I den nuvarande studien testades kryosektioner av olika tjocklekar (4, 8 eller 12 μm). 8 μm-tjocka sektioner befanns vara idealiska för LCM, medan 12 μm ben sektioner var svårare att skära med laser och 4 μm sektioner gav lägre mängder RNA.
Den endogena RNase aktiviteten varierar mellan olika vävnader. Därför kan färgning protokoll som utvecklats för vävnader med mycket låg RNase aktivitet vara olämpliga för andra vävnadstyper. Nuclear fast Red26 och cresyl Violet24 föreslogs vara bäst när det gäller att bevara RNA integritet. Dessutom, alkoholbaserade metoder var överlägsna vatten fläckar för att upprätthålla RNA-integritet. De drabbades dock av irreproducerbara färgintensitet27. Tid är en viktig parameter att överväga. Å ena sidan, den tid som krävs för att söka och identifiera celler av intresse i avsnittet, och att utföra LCM är ofta relativt lång. Å andra sidan är tillgänglig tid för LCM begränsad, eftersom, i vissa fall, 20% RNA-nedbrytning nåddes efter 30 min28. Därför tillämpades olika metoder för att stabilisera RNA, såsom exponering av sektioner för argon Flux under microdissection28, eller användning av buffrad alkoholbaserad cresyl violett färgning och hålla fuktighetsnivån i laboratoriet låg 27. Dessutom föreslogs högst 15 minuter för mikrodissektrappsteget2. I denna studie, frysta ben sektioner färgas med hjälp av ett snabbt protokoll för en kommersiell LCM fläck, och även efter 1 h vid RT, RIN värden minskade från 8,3 till 9,1. Därför utfördes alla mikrodissektioner inom mindre än 1 h efter färgning. Dessutom testades olika protokoll för färgning (med kortare inkuberingar i vattenbaserade reagenser eller utan xylentrappsteget). Ingen signifikant förbättring av RIN-värden uppnåddes.
I LCM-studier har två olika typer av RNA-extraktionsmetoder jämförts: en fas separationsmetod jämfört med en kolumnbaserad metod. Det konstaterades att RNA-extraktionsmetoden baserad på kolonner ledde till bättre RNA-kvalitet och högre avkastning jämfört med fas separationsmetoden8. I en annan studie, ett kommersiellt kit som använder minimal digestionstid och temperatur (5 min vid RT) resulterade i överlägsen RNA-kvalitet jämfört med ett RNA-isolerings kit som behöver längre digestionstid vid högre temperatur (30 min vid 42 ° c)7. I den nuvarande studien var det möjligt att extrahera högkvalitativt RNA (RIN > 8) av tillräcklig koncentration från LCM-prover med hjälp av färskfrysta mus ben och en kolonnbaserad RNA-extraktionsmetod. Noggrann Lys (1 min pipettering i locket) är viktigt för god RNA-avkastning. Effekten av RNA-extraktionsmetoden på RNA-avkastningen och integriteten som erhålls efter LCM undersöktes med hjälp av flera olika RNA-isolerings satser enligt tillverkarens anvisningar. Men bättre kvalitet RNAs och ökad kvantitet erhölls med det kit som används i det optimerade protokollet. I pilotstudien kapades mikrodissekerade vävnads områden på 1 mm2 område, och det var möjligt att isolera cirka 8,5 ng av rnas med 8 μm tjocka ben sektioner (cirka 800 PG/μl). Typiskt, osteoblaster, osteocyter, och ben foder celler fångades i 2 − 3 avsnitt per prov.
Direkta jämförelser mellan olika LCM-instrument är knappa. I en studie, två vanliga LCM instrument testades, som skiljer sig i den typ av laser som används (UV och infraröd [IR], respektive) och metod för att fånga vävnad (självhäftande isolering mössa vs CAPS belagda med transparent termoplastisk film, respektive). Det konstaterades att för tunt-sektionerade färsk fryst mus hjärn sektioner, IR-systemet resulterade i blygsamt högre RNA kvalitet7. I den nuvarande studien jämfördes två LCM-system som medger kontaktfri provinsamling. I ett system faller mikrodissekerade provet med tyngd i locket placerat strax under29. Ett annat system använder en de-fokuserad laserpuls, som katapulter materialet i överhängande locket30. För färska frysta ben, högre RNA-belopp och RIN värden erhölls när tyngdkraften användes för vävnad fånga. Dessutom, den catapulting teknologien är inte förenlig med det "Sandwich" sammansatt av adhesiv hinna, Cryo-del, och sällskapsdjur membran, på grund av den extra vikt om sällskapsdjur membran.
LCM kräver fysisk tillgång till vävnadens yta. Därför är montering och glas beläggning av preparatet oanvändbar, med följden av försämrad visualisering av morfologi. För att övervinna denna begränsning utvecklades ett flytande täckmedium31. Alternativt kan 10 − 15 μL etanol tillsättas direkt på vävnads sektionen, vilket möjliggör en bättre Morfologisk analys före avdunstning2. I den nuvarande studien, frysta ben sektioner klipptes på en självhäftande film och, innan provet tilläts torka helt, det var inklämt mellan PET-membran och filmen. Denna "Sandwich"-metod gav en god morfologisk kontrast och specifika benceller identifierades tydligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar ute Zeitz och Nikole Ginner för deras utmärkta tekniska hjälp samt Vetcore och djuromsorg personal för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
