Summary
Ein Lasercapture Microdissection (LCM) Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die Genexpression in Zellen von hartgeweben zu untersuchen.
Abstract
RNA-Ausbeute und -Integrität sind entscheidend für die RNA-Analyse. Es ist jedoch oft technisch schwierig, die RNA-Integrität während des gesamten Lasercapture Microdissection (LCM)-Verfahrens aufrechtzuerhalten. Da LCM-Studien mit geringen Materialmengen arbeiten, sind auch Bedenken hinsichtlich begrenzter RNA-Ausbeute nera wichtig. Daher wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die Wirkung von Färbeprotokoll, Dicke von Kryosektionen, mikrosezierte Gewebemenge, RNA-Extraktionskit und LCM-System, das auf die RNA-Ausbeute und Integrität von mikrosezierten Knochenzellen verwendet wird, wurde bewertet. Acht Meter dicke gefrorene Knochenabschnitte wurden mit einem Klebefilm hergestellt und mit einem schnellen Protokoll für einen kommerziellen LCM-Fleck gebeizt. Die Probe wurde zwischen einer Polyethylenterephthalatmembran (PET) und der Klebefolie eingeklemmt. Ein LCM-System, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet, und eine säulenbasierte RNA-Extraktionsmethode wurden verwendet, um qualitativ hochwertige RNAs mit ausreichender Ausbeute zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die In-situ-Genexpression in Zellen von hartgeweben sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Krankheitsprozessen zu untersuchen.
Introduction
Gewebe bestehen aus heterogenen und räumlich verteilten Zelltypen. Verschiedene Zelltypen in einem bestimmten Gewebe können unterschiedlich auf dasselbe Signal reagieren. Daher ist es wichtig, spezifische Zellpopulationen für die Beurteilung der Rolle verschiedener Zelltypen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Bedingungen zu isolieren. Lasercapture Microdissection (LCM) bietet eine relativ schnelle und präzise Methode zum Isolieren und Entfernen bestimmter Zellen aus komplexen Geweben1. LCM-Systeme nutzen die Kraft eines Laserstrahls, um die von Interesse interessierten Zellen von histologischen Gewebeabschnitten zu trennen, ohne dass eine enzymatische Verarbeitung oder kulturförderndes Wachstum erforderlich ist. Dies bedeutet, dass sich die Zellen in ihrem natürlichen Gewebelebensraum befinden und dass die Gewebearchitektur einschließlich der räumlichen Beziehung zwischen verschiedenen Zellen erhalten bleibt. Die Morphologie sowohl der eingefangenen Zellen als auch des Restgewebes ist gut erhalten, und mehrere Gewebekomponenten können sequenziell aus demselben Dia abgetastet werden. Isolierte Zellen können dann für die nachfolgende Analyse ihres RNA-, DNA-, Protein- oder Metabolitengehalts2,3verwendet werden.
Um die Genexpression in verschiedenen Zellpopulationen oder nach verschiedenen Behandlungen zu analysieren, ist es notwendig, mRNAs von ausreichender Qualität und Quantität für die nachfolgende Analyse zu erhalten4,5. Im Gegensatz zur DNA sind RNAs empfindlicher auf Fixierung und die Verwendung von gefrorenem Gewebe wird empfohlen, wenn das Ziel darin besteht, RNA zu untersuchen. Da mRNAs durch allgegenwärtige Ribonukleasen (RNase) schnell abgebaut werden, sind strenge RNase-freie Bedingungen bei der Probenhandhabung und -aufbereitung erforderlich und die Vermeidung der Lagerung von Proben bei Raumtemperatur. Darüber hinaus sind schnelle Techniken ohne verlängerte wässrige Phasenschritte entscheidend, um den RNA-Abbau zu verhindern6. Die RNA-Ausbeute und -Integrität kann auch durch den LCM-Prozess und das verwendete LCM-System7,8beeinflusst werden. Derzeit stehen vier LCM-Systeme mit unterschiedlichen Betriebsprinzipien zur Verfügung2. Die Methode der RNA-Extraktion kann ebenfalls wichtig sein, da verschiedene RNA-Isolationskits mit signifikanten Unterschieden in RNA-Menge und-Qualität7,8getestet wurden.
Jede Gewebevorbereitungsmethode erfordert, ein Gleichgewicht zwischen dem Erhalt eines guten morphologischen Kontrasts und der Aufrechterhaltung der RNA-Integrität für weitere Analysen zu finden. Zur Herstellung gefrorener Abschnitte aus Knochen wurde ein Klebefilm entwickelt und kontinuierlich verbessert9. Die Knochenabschnitte werden direkt auf der Klebefolie geschnitten und gebeizt. Dieser Klebefilm ist auf viele Arten von Färbung anwendbar und kann verwendet werden, um die Zellen von Interesse von Knochenkryosektionen mit LCM9,10,11,12,13, zu isolieren 14. Alle Schritte einschließlich der chirurgischen Entfernung, Einbettung, Gefrieren, Schneiden und Färben können innerhalb von weniger als einer Stunde abgeschlossen werden. Wichtig ist, dass Zellen wie Osteoblasten, Knochenfutterzellen und Osteoklasten eindeutig identifiziert werden können9,10,11,12,13,14. Diese Methode hat den Vorteil, schnell und einfach zu sein. Eine alternative Methode zur Erzeugung von Knochenkryosektionen ist die Verwendung des Bandübertragungssystems15. Letztere Technik ist jedoch zeitaufwändiger und erfordert zusätzliche Instrumentierung, da die Abschnitte durch ultraviolette (UV) Vernetzung vom Klebeband auf vorbeschichtete Membranschlitten übertragen werden müssen. Obwohl das Bandübertragungssystem erfolgreich mit LCM16,17,18,19gekoppelt wurde, ist zu beachten, dass die vernetzte Beschichtung ein Hintergrundmuster erzeugen kann, das kann die Zelltyp-Identifikation20stören.
Typischerweise werden nur geringe Mengen rna aus mikrosesektierten Zellen extrahiert, und RNA-Qualität und -Menge werden oft durch mikrokapillare Elektrophorese21bewertet. Ein Computerprogramm wird verwendet, um RNA-Extrakten, die als RNA-Integritätsnummer (RIN) bezeichnet werden, einen Qualitätsindex zuzuweisen. Ein RIN-Wert von 1,0 gibt vollständig abgebaute RNA an, während ein Wert von 10,0 darauf hindeutet, dass die RNA vollständig intakt ist22. In der Regel werden Indizes über 5 als ausreichend für RNA-Studien betrachtet. Genexpressionsmuster in Proben mit einem RIN-Wert von 5,0 bis 10,0 korrelieren den Angaben zufolge gut miteinander23. Obwohl die Sensitivität dieser Methode hoch ist, da nur 50 pg/l der gesamten RNA nachgewiesen werden können, kann es sehr schwierig sein, eine Qualitätsbewertung zu erhalten, wenn die RNA-Konzentration in der Probe sehr gering ist. Um die RNA-Qualität zu beurteilen, wird daher der nach dem LCM verbleibende Gewebeabschnitt häufig zur Extraktion von RNA verwendet, indem der Puffer auf denDia24pipetiert wird.
Obwohl LCM ausgiebig auf verschiedenen gefrorenen Geweben verwendet wurde, werden RIN-Werte von extrahierten RNAs selten berichtet. Darüber hinaus gibt es keine vergleichenden Studien, um die am besten geeignete Methode zur Untersuchung von RNA in Mausknochen zu klären. In der vorliegenden Studie wurden gefrorene Abschnitte von erwachsenen Mausfemuren verwendet, um die Probenvorbereitung, das LCM-Protokoll und die RNA-Extraktion zu optimieren, um qualitativ hochwertige RNAs zu erhalten. Das vorliegende Protokoll wurde speziell für das LCM-System optimiert, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet.
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Protocol
Knochengewebe von Mäusen wurde in strikter Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien für die Tierpflege verwendet und alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren.
1. Tiere und Gefrierbett
- Haustiere unter Bedingungen mit konstanter Raumtemperatur (RT; 24 °C) und einem 12 h hellen/12 h dunklen Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
ANMERKUNG: Knochengewebe wurden in dieser Studie von 3 Monate alten männlichen Wild-Mäusen des Typs C57BL/6 gewonnen. - Bei Nekropsie, Exsanguinate Mäuse aus dem Abdominal Vena cava unter Vollnarkose (Ketamin/Xylazin, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
HINWEIS: Um einen RNA-Abbau zu vermeiden, verwenden Sie RNase-freie Instrumente und Materialien, tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie schnell die Lagerung von Proben bei RT während des gesamten Experiments. - Entfernen Sie ganze Oberschenkelknochen schnell, reinigen Sie sie von umgebenden Weichteilen mit Skalpell und Papiertüchern. Gießen Sie die optimale Schnitttemperatur (OCT) Verbindung in die Einbettform, und legen Sie den Oberschenkelknochen in den Boden der Einbettform. Fangen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein. OCT ist bei RT transparent und weiß, wenn es eingefroren wird.
- Nach dem völligen Einfrieren die Proben in Folie wickeln und auf Trockeneis auf -80 °C übertragen. Proben bei -80 °C bis zur Weiterverarbeitung lagern.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
2. Abschnittsvorbereitung
- Stellen Sie die Temperatur im Kryostat auf -19 °C und des Blockhalters auf -17 °C ein. Wischen Sie das Cryostat-Innere mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Einwegklinge für hartes Gewebe, die Glasgletten und ein passendes Werkzeug in den Kryostat zum Abkühlen. Halten Sie sie im Kryostat für die Dauer des Schnittes.
- Übertragen Sie den gefrorenen Gewebeblock auf Trockeneis in den Kryostat und lassen Sie ihn für mindestens 10 min ausgrenzen.
HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und häufiges Radfahren eines Blocks von -80 °C bis -19 °C für Kryosektionen. - Drücken Sie den Boden der Einbettform, um den OCT-Block aus der Form zu schieben. Tragen Sie genügend OCT-Medium auf den Blockhalter auf, um den Block daran zu kleben. Warten Sie, bis das OCT-Medium vollständig eingefroren ist.
- Legen Sie den Blockhalter in den Objekthalter und ziehen Sie ihn fest. Passen Sie die Klingenposition an, und trimmen Sie den Block mit 15 m Schnittschritten, um das OCT zu entfernen, das die Probe bedeckt. Wenn die Probe früher geschnitten wurde und die Oberfläche Luft ausgesetzt wurde, entsorgen Sie die ersten 2-3 Gewebeabschnitte aus dem Block.
- Passen Sie den Kryostat so an, dass er 8 m Abschnitte erzeugt, und schneiden Sie die 2-3 Kryosektionen, die verworfen werden (die ersten paar sind in der Regel dicker als 8 m). Legen Sie die Klebefolie auf den Block und verwenden Sie ein Montagewerkzeug, um die Folie am Block zu befesten. Machen Sie den Schnitt langsam und mit konstanter Geschwindigkeit halten den Abschnitt durch den Film.
- Legen Sie den Film (Probe nach oben) sofort auf eine vorgekühlte Glasrutsche (auf der Kryobar innerhalb des Kryostats), um ein Auftauen der Probe zu vermeiden. Verwenden Sie Klebeband, um den Film an der Glasfolie zu befestigen, um die Färbung zu erleichtern. Fahren Sie sofort mit dem Färbeprotokoll fort.
3. Schnelles Färbeprotokoll
- Bereiten Sie 40 ml der folgenden Lösungen in 50 ml-Rohren vor und legen Sie sie auf Eis: 95% Ethanol, RNase-freies Wasser, 100% Ethanol, 100% Ethanol und 100% Xylol. Führen Sie alle Schritte auf Eis (außer der Färbung) aus. Für jeden Versuchstag alle wässrigen Reagenzien frisch mit RNase-freiem Wasser zubereiten.
ACHTUNG: Arbeiten Sie in der Kapuze, um eine Vergiftung durch Xylol zu vermeiden. - Inkubieren Sie Abschnitte für 30 s in 95% Ethanol, dann tauchen Abschnitte 30 s in RNase-freies Wasser, um OCT sorgfältig und vollständig zu entfernen, was LCM und nachgeschaltete Anwendungen stören kann.
- Geben Sie 50 l kommerziellen LCM-Tiefschnittfleck (Materialtabelle) auf den Abschnitt, inkubieren Sie 10 s bei RT und entleeren Sie ihn, indem Sie den Rand des Schlittens auf saugfähiges Gewebepapier legen. Entfernen Sie überschüssige Flecken, indem Sie 30 s in 100% Ethanol spülen.
- Eintauchen von Knochenabschnitten in ein zweites Rohr mit 100% Ethanol für 30 s und übertragen Sie sie auf 100% Xylol für 30 s.
- Klebefolie (Probe nach oben) als Stütze auf trockeneglasrutsche setzen. Achten Sie darauf, dass der Film nicht beeinflusst und so flach wie möglich platziert wird. Lassen Sie die Probe nicht vollständig trocknen.
- Legen Sie einen PET-Membranrahmenschlitten darauf. Drücken Sie kurz einen Handfinger auf die Membran, um sie am Film zu befestigen. Die Probe wird dann zwischen membran- und klebefolie eingeklemmt. Die Klebefolie sollte nicht gefaltet oder faltig sein und es sollte keine Luftblasen zwischen der Folie und der Membran geben. Fahren Sie sofort mit dem LCM fort.
4. Laser Capture Mikrodissektion
- Reinigen Sie den Stufen- und Kappenhalter von RNase mit Oberflächendekontamination (Materialtabelle). Laden Sie den Schlitten und die Kappen in den Schiebehalter bzw. den Kappenhalter.
- Passen Sie den Fokus an und erhalten Sie die Folienübersicht mit dem 1,25-fachen Objektiv. Wechseln Sie zum 40x-Objektiv und passen Sie den Fokus an. Wählen Sie den Interessenbereich mithilfe der Folienübersicht aus. Laserparameter wie folgt einstellen: Blende, 7; Laserleistung, 60; Geschwindigkeit, 5; Pulsfrequenz, 201; Probenbilanz, 20. Optimieren Sie diese Parameter für jedes Ziel.
- Wenn der Laser die Probe nicht schneidet, erhöhen Sie die Laserleistung. Alternativ kann der Laser mehr als einmal eingesetzt werden. Überprüfen Sie außerdem das Ziel auf Punkte unvollständiger Schnitte, und ziehen Sie die Linie an diesen Stellen mit der Option Verschieben und Schneiden neu. Speichern Sie Lasereinstellungen für die Sezierung nachfolgender Dias.
- Wählen Sie Osteoblasten, Osteozyten und Knochenfutterzellen in distalen femoralen Cancellous oder kortikalen Knochen auf der Grundlage morphologischer Kriterien. Zeichnen Sie eine Linie für den Laserpfad weiter weg von den Zielzellen, um die Schäden durch den UV-Laser zu minimieren. Führen Sie alle Mikrodissektionen innerhalb von weniger als 1 h nach der Färbung durch.
- Sammeln Sie jeden Zelltyp in einer separaten Kappe eines 0,5 ml Rohres.
HINWEIS: Trockenerfassung statt Flüssigkeitsrückgewinnung kann den ABBAU der RNA vermeiden. Darüber hinaus können sehr kleine Puffermengen, die in der Kappe des Mikrozentrifugenrohres enthalten sind, während des LCM entweder verdampfen oder kristallisieren (je nach Zusammensetzung). - Bestätigen Sie den Erfassungserfolg, indem Sie die Sammelrohrkappe nach dem LCM beobachten, sofern zutreffend. Fahren Sie sofort mit der RNA-Extraktion fort.
5. RNA-Extraktion
- Geben Sie 50 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, in die Kappe des Sammelrohres und lyse die Probe, indem Sie die Probe 1 min in der Kappe nach oben und unten pfeifen. Drehen Sie das Lysat nach unten und fügen Sie 300 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, in das Rohr ein. Wenn mehrere Kappen gepoolt werden sollen, achten Sie darauf, dass das Gesamtvolumen des Puffers wie für das RNA-Extraktionskit (Tabelle der Materialien )empfohlen wird.
VORSICHT: Mercaptoethanol muss zugesetzt werden, um die RNA vor Abbau zu schützen, gilt aber als toxisch. Tragen Sie Schutzkleidung und Handschuhe und arbeiten Sie in der Kapuze. - Darüber hinaus bereiten Sie für jede Folie ein beschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 350 l des Lysepuffers vor, der das Mercaptoethanol enthält. Verwenden Sie die nach dem LCM verbleibenden Abschnitte, um RNA zu extrahieren. Trennen Sie den Film vorsichtig von der Membran und lysieren Sie die Probe, indem Sie den Lysepuffer mehrmals langsam auf den Abschnitt pfeifen.
HINWEIS: Die Gesamtmenge des Lysepuffers sollte 350 L betragen. Verwenden Sie nicht alles auf einmal für die Verdauung, da es von der Folie fließen wird. -
Die Lysatproben auf Trockeneis legen und bei -80 °C aufbewahren.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Die Lysate bei RT auftauen. Lysate aus LCM-geernteten Zellen aus Sammelrohren in die 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre übertragen. Wenn mehr als eine Kappe verwendet wurde, um die Probe zu ernten, poolieren Sie mehrere Lysate.
- Extrahieren Sie RNA nach den Anweisungen des Herstellers. Behandeln Sie Spalten mit DNase I, um genomische DNA zu entfernen. Elute-RNA mit 14 l RNase-freiem Wasser, was zu einem 12-L-Eluat führt. RNA bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
6. Messung der RNA-Ausbeute und -Integrität
- RNA auf nassem Eis auftauen. Messen Sie die Ausbeute und Integrität isolierter RNA mit mikrokapillarer Elektrophorese. Laden Sie die Gesamt-RNA (1 L pro Probe) gemäß den Anweisungen des Herstellers in einen Chip (Materialtabelle).
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Representative Results
Ein LCM-Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen von Mausfemuren zu erhalten. Im optimierten Protokoll wurden 8 m dicke gefrorene Knochenabschnitte auf einer Klebefolie geschnitten und mit einem schnellen Protokoll für einen kommerziellen LCM-Tiefschnittfleck gebeizt. Die Probe wurde zwischen der PET-Membran und der Klebefolie eingeklemmt. Mausknochenzellen wurden mit einem LCM-System mikroseziert, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet. Eine säulenbasierte RNA-Extraktionsmethode wurde verwendet, um eine qualitativ hochwertige RNA mit ausreichender Ausbeute zu erhalten. Die Ausbeute und Integrität isolierter RNA wurde mit Hilfe einer mikrokapillaren Elektrophorese gemessen (Abbildung 1).
Der Unterschied in der RNA-Qualität und -Menge, der mit verschiedenen Lyseprotokollen gewonnen wird, ist in den repräsentativen Gel- und Elektropherogrammen zu sehen. Wenn die Probe durch Pipettieren in der Kappe für 1 min nach oben und unten lysiert wurde, war es möglich, ca. 8,5 ng RNA aus 1 mm2 mikroseziertem Knochengewebe (8 m dicker Abschnitt) zu isolieren. Der RIN-Wert betrug 8,60 (Abbildung 2).
Alternativ wurde LCM mit einem LCM-System durchgeführt, das defokussierten Laserpuls verwendet, der das Material in die überhängende Klebekappe katapultiert. RNA-Qualität und -Menge können in den repräsentativen Gel- und Elektropherogrammen geschätzt werden. Bei frischen gefrorenen Knochen konnten ca. 1,6 ng RNA aus 1 mm2 mikroseziertem Knochengewebe (8 m dicker Abschnitt) isoliert werden. Der RIN-Wert war 1 (Abbildung 3).
Abbildung 1: Flussdiagramm des Laser-Capture-Mikrodissektionsprotokolls für frisch gefrorene Knochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives Gel (oben) und Elektropherogramme (unten) von RNA-Proben. LCM wurde mit einem LCM-System durchgeführt, das die Schwerkraft für die Probensammlung verwendet. RNA-Proben wurden aus LCM-geerntetem Gewebe (Proben 1, 3, 5, 7 und 9) und entsprechenden Kontrollabschnitten (Proben 2, 4, 6, 8 und 10) entnommen. Eine RNA-Probe wurde aus dem Kontrollabschnitt entnommen, der gebeizt, aber nicht für LCM verwendet wurde (Probe 11). Eine Gesamtfläche von 1 mm2 wurde mikroseziert und verschiedene Lyseprotokolle verwendet. Probe 1: 350 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, wurden in die Röhre aufgenommen. Die Kappe wurde vorsichtig geschlossen und das Rohr invertiert. LCM-geerntete Zellen wurden durch Wirbeln von 1 min, Inkubation bei RT für 10 min und Wirbel1 min lysiert. Probe 3: 350 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, wurde in das Sammelrohr aufgenommen, die Kappe sorgfältig geschlossen und das Rohr invertiert. LCM-geerntete Zellen wurden durch inkubierende Sammelrohre für 30 min bei RT auf den Kopf gelysiert. Probe 5: 50 l des Lysepuffers, der das -Mercaptoethanol enthält, wurde in die Kappe des Sammelrohres aufgenommen und die Probe wurde durch Pipettieren in der Kappe für 1 min lysiert. Das Lysat wurde zentrifugiert und 300 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthielt, wurde in das Rohr aufgenommen. Probe 7: 350 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, wurde in die Röhre aufgenommen. Die Kappe wurde vorsichtig geschlossen und das Rohr invertiert. LCM-geerntete Zellen wurden mehrmals durch Wirbel und Invertieren lysiert. Probe 9: 50 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, wurde in die Kappe des Sammelrohrs aufgenommen, und die Probe wurde durch Inkubation für 5 min bei RT in der Kappe lysiert. Das Lysat wurde zentrifugiert, und dem Röhrchen wurde 300 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthielt, zugesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Gel (oben) und Elektropherogramme (unten) von RNA-Proben. LCM wurde mit einem LCM-System durchgeführt, das defokussierten Laserpuls verwendet, der das Material in die über dem Abschnitt positionierte Klebekappe katapultiert. RNA-Proben wurden aus LCM-geerntetem Gewebe (Proben 5 und 6) und dem entsprechenden Kontrollteil (Probe 7) entnommen. Eine RNA-Probe wurde aus dem Kontrollabschnitt entnommen, der gebeizt, aber nicht für LCM verwendet wurde (Probe 8). Eine Gesamtfläche von 0,5 mm2 bzw. 1 mm2 wurde mikroseziert (Proben 5 bzw. 6). 350 l des Lysepuffers, der das Mercaptoethanol enthält, wurde in das Sammelrohr aufgenommen, die Kappe sorgfältig geschlossen und das Rohr invertiert. LCM-geerntete Zellen wurden durch inkubieren dekubierte Sammelrohre auf den Kopf für 30 min bei RT lysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Sowohl die RNA-Qualität als auch die RNA-Menge können in allen Stadien der Probenvorbereitung negativ beeinflusst werden, wie z. B. Gewebemanipulation, LCM-Prozess und RNA-Extraktion. Daher wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die nachfolgende Genexpressionsanalyse zu erhalten.
Für LCM verwenden die meisten Laboratorien Abschnitte mit einer Dickevon 7bis 8 m 2 . Dickere Abschnitte würden es ermöglichen, mehr Material zu ernten. Wenn sie jedoch zu dick sind, könnte dies die mikroskopische Auflösung reduzieren und der Laser kann möglicherweise nicht durchschneiden. Es ist wahrscheinlich, dass die optimale Gewebedicke vom verwendeten LCM-System (und dem verwendeten Laser- und Gleitgangtyp) sowie vom Gewebe in Frage8,25abhängt. In der vorliegenden Studie wurden Kryosektionen unterschiedlicher Dicke (4, 8 oder 12 m) getestet; Es wurde festgestellt, dass 8 m dicke Abschnitte ideal für LCM waren, während 12 'm Knochenabschnitte mit dem Laser schwieriger zu schneiden waren und 4 'm Abschnitte weniger RNA lieferten.
Die endogene RNase-Aktivität variiert zwischen den verschiedenen Geweben. Daher könnten Färbeprotokolle, die für Gewebe mit sehr geringer RNase-Aktivität entwickelt wurden, für andere Gewebetypen ungeeignet sein. Nuclear fast red26 und cresyl violett24 wurden als die besten in Bezug auf die Erhaltung der RNA-Integrität vorgeschlagen. Darüber hinaus waren alkoholbasierte Methoden wässrigen Flecken überlegen, um die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Sie litten jedoch unter einer nicht reproduzierbaren Färbeintensität27. Zeit ist ein wichtiger Parameter, den es zu berücksichtigen gilt. Einerseits ist die Zeit, die benötigt wird, um Zellen zu suchen und zu identifizieren, die in diesem Abschnitt von Interesse sind, und für die Durchführung von LCM oft relativ lang. Auf der anderen Seite ist die für LCM verfügbare Zeit begrenzt, da in einigen Fällen nach 30 min28ein 20%iger RNA-Abbau erreicht wurde. Daher wurden verschiedene Methoden angewendet, um die RNA zu stabilisieren, wie die Exposition von Abschnitten gegenüber Argonfluss während der Mikrodissektion28, oder die Verwendung von gepufferten alkoholbasierten Kresylviolettfärbungen und die Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit im Labor niedrig. 27. Darüber hinaus wurde maximal 15 min für den Mikrodissektionsschritt vorgeschlagen2. In dieser Studie wurden gefrorene Knochenabschnitte mit einem schnellen Protokoll für einen kommerziellen LCM-Fleck gefärbt, und selbst nach 1 h bei RT sanken die RIN-Werte von 8,3 auf 9,1. Daher wurden alle Mikrodissektionen innerhalb von weniger als 1 h nach der Färbung durchgeführt. Darüber hinaus wurden verschiedene Protokolle für die Färbung getestet (mit kürzeren Inkubationen in wässrigen Reagenzien oder ohne Xylolschritt). Eine signifikante Verbesserung der RIN-Werte wurde nicht erreicht.
In LCM-Studien wurden zwei verschiedene Arten von RNA-Extraktionsmethoden verglichen: eine Phasentrennungsmethode im Vergleich zu einer spaltenbasierten Methode. Es wurde festgestellt, dass die auf Säulen basierende RNA-Extraktionsmethode zu einer besseren RNA-Qualität und einer höheren Ausbeute im Vergleich zur Phasentrennungsmethode8führte. In einer anderen Studie führte ein kommerzielles Kit, das minimale Verdauungszeit und Temperatur (5 min bei RT) verwendet, zu einer überlegenen RNA-Qualität im Vergleich zu einem RNA-Isolationskit, das längere Verdauungszeit bei höherer Temperatur benötigt (30 min bei 42 °C)7. In der vorliegenden Studie war es möglich, hochwertige RNA (RIN > 8) mit Hilfe von frisch gefrorenen Mausknochen und einer säulenbasierten RNA-Extraktionsmethode aus LCM-Proben zu extrahieren. Eine gründliche Lyse (1 min Pipettierung in der Kappe) ist für eine gute RNA-Ausbeute unerlässlich. Die Wirkung der RNA-Extraktionsmethode auf die RNA-Ausbeute und -Integrität, die nach LCM erzielt wurde, wurde mit mehreren verschiedenen RNA-Isolationskits gemäß den Anweisungen der Hersteller untersucht. Mit dem im optimierten Protokoll verwendeten Kit wurden jedoch höhere RNAs und erhöhte Mengen erzielt. In der Pilotstudie wurden mikrosezierte Gewebebereiche von 1 mm2 Endfläche geschnitten, und es war möglich, ca. 8,5 ng RNAs mit 8-mm-dicken Knochenabschnitten (ca. 800 pg/l) zu isolieren. Typischerweise wurden Osteoblasten, Osteozyten und Knochenfutterzellen in 2-3 Abschnitten pro Probe gefangen.
Direkte Vergleiche zwischen verschiedenen LCM-Instrumenten sind rar. In einer Studie wurden zwei gängige LCM-Instrumente getestet, die sich in der Art des verwendeten Lasers (UV und Infrarot [IR]) und der Methode zur Gewebeerfassung unterscheiden (Klebstoff-Isolationskappe vs. Kappen, die mit transparentem thermoplastischem Film beschichtet sind). Es wurde festgestellt, dass für dünn geschnittene frisch gefrorene Maus-Gehirnabschnitte das IR-System zu einer bescheiden höheren RNA-Qualität führte7. In der vorliegenden Studie wurden zwei LCM-Systeme verglichen, die eine berührungslose Probenentnahme ermöglichen. In einem System fällt die mikrosezierte Probe durch Schwerkraft in die knapp unter29platzierte Kappe. Ein anderes System verwendet einen defokussierten Laserpuls, der das Material in die überhängende Kappe30katapultiert. Bei frischen gefrorenen Knochen wurden höhere RNA-Mengen und RIN-Werte ermittelt, wenn die Schwerkraft für die Gewebeaufnahme verwendet wurde. Darüber hinaus ist die Katapulttechnologie aufgrund des zusätzlichen Gewichts der PET-Membran nicht kompatibel mit dem "Sandwich", das aus Klebefolie, Kryo-Sektion und PET-Membran besteht.
LCM erfordert physischen Zugriff auf die Gewebeoberfläche. Daher ist die Montage und Glasabdeckung der Probe nicht anwendbar, mit der Folge einer beeinträchtigten Visualisierung der Morphologie. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde ein fluides Abdeckungsmedium entwickelt31. Alternativ können 10 bis 15 L Ethanol direkt auf dem Gewebeabschnitt zugesetzt werden, was eine bessere morphologische Analyse vor der Verdunstung2ermöglicht. In der vorliegenden Studie wurden gefrorene Knochenabschnitte auf einem Klebefilm geschnitten, und bevor die Probe vollständig trocknen durfte, wurde sie zwischen der PET-Membran und der Folie eingeklemmt. Diese "Sandwich"-Methode ergab einen guten morphologischen Kontrast und bestimmte Knochenzellen wurden eindeutig identifiziert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Ute Zeitz und Nikole Ginner für ihre hervorragende technische Hilfe sowie dem Vetcore- und Tierpfleger für die Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
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