Summary
En laser Capture microdissection (LCM) protokol blev udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde af høj kvalitet RNA til genekspression analyse i knogleceller. Den aktuelle undersøgelse fokuserer på musens femur sektioner. Den LCM-protokol, der rapporteres her, kan dog bruges til at studere genekspression i celler i ethvert hårdt væv.
Abstract
RNA-udbytte og-integritet er afgørende for RNA-analyse. Men, det er ofte teknisk udfordrende at opretholde RNA integritet gennem hele laser opsamling microdissection (LCM) procedure. Da LCM-studierne arbejder med lave mængder materiale, er bekymringerne om begrænsede RNA-udbytter også vigtige. Derfor blev en LCM-protokol udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til analyse af genekspression i knogleceller. Virkningen af farvnings protokollen, tykkelsen af kryosektioner, mikrodissekeret vævs mængde, RNA-ekstraktions kit og LCM-system, der anvendes på RNA-udbytte og integritet opnået fra mikrodissekerede knogleceller, blev evalueret. Otte-μm-tykke frosne knogle sektioner blev lavet ved hjælp af en klæbende film og plettet ved hjælp af en hurtig protokol til en kommerciel LCM plet. Prøven blev klemt inde mellem en polyethylenterephthalatmembran (PET) og den selvklæbende folie. Et LCM-system, der bruger tyngdekraften til prøveopsamling og en kolonne baseret RNA-ekstraktionsmetode, blev brugt til at opnå tilstrækkelig udbytte af højkvalitets RNAs. Den aktuelle undersøgelse fokuserer på musens femur sektioner. Den LCM-protokol, der rapporteres her, kan dog bruges til at studere in situ-genekspression i celler i ethvert hårdt væv i både fysiologiske forhold og sygdomsprocesser.
Introduction
Væv består af heterogene og rummæssigt distribuerede celletyper. Forskellige celletyper i et givet væv kan reagere forskelligt på det samme signal. Derfor er det vigtigt at være i stand til at isolere specifikke cellepopulationer til vurdering af rollen af forskellige celletyper i både fysiologiske og patologiske forhold. Laser opsamling microdissection (LCM) tilbyder en relativt hurtig og præcis metode til isolering og fjernelse af specificerede celler fra komplekse væv1. LCM-systemer bruger kraften i en laserstråle til at adskille de celler af interesse fra histologiske vævs sektioner uden behov for enzymatisk behandling eller vækst i kulturen. Det betyder, at cellerne er i deres naturlige vævs habitat, og at vævs arkitekturen, herunder det geografiske forhold mellem forskellige celler, bevares. Morfologi af både de tilfangetagne celler og det resterende væv er velbevaret, og flere vævs komponenter kan udtages sekventielt fra samme slide. Isolerede celler kan derefter anvendes til efterfølgende analyse af deres RNA-, DNA-, protein-eller metabolit-indhold2,3.
For at analysere genekspression i forskellige cellepopulationer, eller efter forskellige behandlinger, er det nødvendigt at få mRNAs af tilstrækkelig kvalitet og mængde til den efterfølgende analyse4,5. I modsætning til DNA er RNAs mere følsomme over for fiksering, og brugen af frosset væv anbefales, når målet er at studere RNA. Da mRNAs hurtigt nedbrydes af allestedsnærværende ribonucleaser (RNase), er der behov for strenge RNase frie forhold under prøvehåndtering og klargøring og undgå opbevaring af prøver ved stuetemperatur. Desuden er hurtige teknikker uden længerevarende vandige fase trin afgørende for at forhindre RNA-nedbrydning6. RNA-udbyttet og-integriteten kan også påvirkes af LCM-processen, og LCM-systemet brugte7,8. I øjeblikket er fire LCM-systemer med forskellige driftsprincipper tilgængelige2. Metoden til RNA-ekstraktion kan også være vigtig, da forskellige RNA-isolations kits er blevet testet med betydelige forskelle i RNA-kvantitet og kvalitet7,8.
Enhver vævs præparationsmetode kræver at finde en balance mellem opnåelse af god morfologisk kontrast og opretholdelse af RNA-integritet til yderligere analyser. Til fremstilling af frosne sektioner fra knogler, en klæbende film blev udviklet og løbende forbedret9. Knogle sektionerne skæres og farves direkte på den selvklæbende film. Denne klæbende film gælder for mange typer af farvning, og kan anvendes til at isolere de celler af interesse fra knogle kryosektioner ved hjælp af LCM9,10,11,12,13, 14. Alle trinene, herunder kirurgisk fjernelse, indlejring, frysning, skæring og farvning kan afsluttes inden for mindre end en time. Det er vigtigt, at celler som osteoblaster, knogle foring celler og osteoklaster tydeligt kan identificeres9,10,11,12,13,14. Denne metode har den fordel at være hurtig og enkel. En alternativ metode til generering af knogle kryosektioner er at bruge tape transfersystemet15. Men sidstnævnte teknik er mere tidskrævende og kræver yderligere instrumentering, da afsnittene skal overføres fra Klæbebåndet til præbelagte membran glider ved ultraviolet (UV) Cross-Linking. Selv om tape transfersystemet er blevet kombineret med LCM16,17,18,19, skal det bemærkes, at den tvær tilknyttede belægning kan skabe et baggrundsmønster, der kan interferere med celle-type identifikation20.
Typisk udvindes kun små mængder af RNA fra mikrodissekerede celler, og RNA-kvalitet og-mængde vurderes ofte ved mikrokapillær elektroforese21. Et edb-program bruges til at tildele et kvalitetsindeks til RNA-ekstrakter kaldet RNA-integritets nummer (RIN). En RIN-værdi på 1,0 indikerer fuldstændig forringet RNA, hvorimod en værdi på 10,0 antyder, at RNA er fuldt intakt22. Normalt, indekser over 5 anses for tilstrækkelige til RNA-undersøgelser. Genekspressions mønstre i prøver med en RIN-værdi på 5,0 − 10,0 er blevet rapporteret til at korrelere godt med hinanden23. Selv om følsomheden af denne metode er høj, da så lidt som 50 PG/μL af total RNA kan påvises, det kan være meget vanskeligt at opnå en kvalitetsvurdering, hvis RNA koncentrationen i prøven er meget lav. For at vurdere RNA-kvaliteten anvendes den vævs sektion, der er tilbage efter LCM'EN, ofte til at udtrække RNA ved pipette Rings buffer på diaset24.
Selvom LCM har været anvendt i udstrakt grad på forskellige frosne væv, er RIN-værdierne af ekstraherede RNAs sjældent indberettet. Desuden er der ingen sammenlignende undersøgelser for at præcisere den mest hensigtsmæssige metode til at studere RNA i mus knogler. I nærværende undersøgelse blev frosne sektioner fra voksne mus skinneben er fuldstændig brugt til at optimere prøveforberedelse, LCM-protokol og RNA-ekstraktion for at opnå højkvalitets RNAs. Denne protokol blev optimeret specielt til LCM-systemet, der bruger tyngdekraften til prøveopsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Knoglevæv fra mus blev brugt i nøje overensstemmelse med gældende retningslinjer for dyrepleje og alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrs lidelser.
1. dyr og fryse indlejring
- Husdyr under forhold med konstant rumtemperatur (RT; 24 °C) og 12 timer lys/12 h mørk cyklus med fri adgang til mad og vand.
Bemærk: knoglevævet i dette studie blev opnået fra 3-måneders-gammel mandlig vildtype C57BL/6-mus. - Ved nekropsy, afblødning mus fra abdominal Vena cava under generel anæstesi (ketamin/xylazine, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
Bemærk: For at undgå RNA-nedbrydning skal du bruge RNase-frie instrumenter og materialer, bære handsker og arbejde hurtigt undgå opbevaring af prøver på RT gennem hele eksperimentet. - Fjern hele skinneben er fuldstændig hurtigt, rense dem af omgivende bløde væv ved hjælp af skalpel og papirhåndklæder. Hæld optimal skære temperatur (OCT) sammensatte i indlejrings formen, og sæt femur i bunden af indlejrings formen. Snap-fryse prøverne i flydende nitrogen. OCT er transparent ved RT og hvid, når den er frosset.
- Når helt frosset, wrap prøverne i folie og overføre dem på tøris til-80 °C. Opbevar prøverne ved-80 °C indtil videre forarbejdning.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
2. forberedelse af afsnit
- Indstil temperaturen i kryostaten til-19 °C og i blok holderen til-17 °C. Tør kryostat interiør med 70% ethanol. Anbring engangs bladet til hårde væv, glas gliderne og et monteringsværktøj i kryostaten for at køle af. Opbevar dem inde i kryostat under skæring.
- Den frosne vævs blok overføres på tøris til kryostaten, så den kan ækvibrere i mindst 10 minutter.
Bemærk: Undgå gentagne optøning og hyppig cykling af en blok fra-80 °C til-19 °C for kryosectioning. - Tryk på bunden af indlejrings formen for at skubbe OLT-blokken ud af formen. Anvende nok OLT medium til blokken indehaveren til at overholde blokken til det. Vent, indtil OLT-mediet er helt frosset.
- Anbring blok holderen i objekt holderen, og stram den på plads. Juster kniv positionen og trim blokken ved hjælp af 15 μm skære intervaller for at fjerne OLT, der dækker prøven. Hvis prøven er blevet skåret tidligere og overfladen udsat for luft, kasseres de første 2 − 3 vævs sektioner fra blokken.
- Justér kryostat for at generere 8 μm sektioner og skær 2 − 3 kryosektioner, der vil blive kasseret (de første par vil typisk være tykkere end 8 μm). Placer den selvklæbende film på blokken og brug et tilpasningsværktøj til at overholde filmen til blokken. Lav snittet langsomt og med en konstant hastighed, der holder afsnittet ved filmen.
- Anbring filmen (prøven vender opad) med det samme på et forkølet glas skred (på cryobar i kryostaten) for at undgå optøning af prøven. Brug tape til at rette filmen til glas sliden for lettere farvning. Fortsæt straks med farvnings protokollen.
3. hurtig farvnings protokol
- Forbered 40 mL af følgende opløsninger i 50 mL rør og læg dem på is: 95% ethanol, RNase-fri vand, 100% ethanol, 100% ethanol og 100% xylen. Udfør alle trin på is (undtagen farvning). For hver eksperimentel dag, Forbered alle vandige reagenser frisk med RNase-fri vand.
Forsigtig: Arbejd i hætten for at undgå forgiftning af xylen. - Incubate sektioner for 30 s i 95% ethanol, derefter dip sektioner 30 s i RNase-fri vand til at fjerne OLT omhyggeligt og fuldstændigt, som kan forstyrre LCM og downstream applikationer.
- Der dispenserer 50 μL kommercielt LCM frossen sektion (tabel over materialer) på afsnittet, inkuberes i 10 s ved RT og dræne den ved at placere kanten af sliden på absorberende vævs papir. Fjern overskydende pletter ved skylning 30 s i 100% ethanol.
- Nedsænk knogle sektioner i et andet rør med 100% ethanol til 30 s og overfør dem til 100% xylen for 30 s.
- Sæt selvklæbende film (prøven vender opad) på tørt glas slide som en støtte. Pas på, at filmen ikke påvirkes og placeres så fladt som muligt. Lad ikke prøven tørre helt.
- Placer en PET-membran ramme slide på den. Tryk kortvarigt på en dykket finger på membranen for at fastgøre den til filmen. Prøven er derefter klemt inde mellem membranen og den selvklæbende film. Den selvklæbende film bør ikke foldes eller rynket, og der bør ikke være nogen luftbobler mellem filmen og membranen. Fortsæt straks med LCM'EN.
4. Mikrodissektion til laser optagelse
- Rengør Stage-og Cap-holderen fra RNase ved hjælp af overflade-deinant (tabel over materialer). Læg henholdsvis diaset og hætterne i slide holderen og holderen til hætten.
- Juster fokus, og Hent slide oversigt med 1,25 x objektiv. Skift til 40x-målsætningen, og Juster fokus. Vælg det interesseområde, som bruger slide oversigten. Juster laser parametre som følger: blænde, 7; laser effekt, 60; hastighed, 5; pulsfrekvens, 201; model balance, 20. Optimer disse parametre for hver målsætning.
- Hvis laseren undlader at skære prøven, øge laser effekt. Alternativt kan laseren anvendes mere end én gang. Desuden inspicere målet for pletter af ufuldstændige nedskæringer og re-trukket linjen i disse pletter ved hjælp af Move og cut option. Gem laser indstillinger for dissektion af efterfølgende dias.
- Vælg osteoblaster, osteocytter og knogle foring celler i distale femoralsk spongiøs eller kortikale knogle baseret på morfologiske kriterier. Tegn en linje for laser sti længere væk fra målcellerne for at minimere skaderne ved UV-laseren. Udfør alle mikrodissektioner inden for mindre end 1 time efter farvning.
- Saml hver celletype i et separat låg på et 0,5 mL rør.
Bemærk: Tør indfangning i stedet for væske genvinding kan undgå RNA-nedbrydning. Desuden kan meget små buffer mængder, der er indeholdt i mikrocentrifuge rørets hætte, enten fordampe eller krystallisere (afhængigt af dens sammensætning) under LCM'EN. - Bekræft optagelse succes ved observation af samlingen tube Cap efter LCM hvor det er relevant. Fortsæt straks med RNA-ekstraktionen.
5. RNA-ekstraktion
- 50 μL af den lyse buffer, der indeholder β-mercaptoethanol, dispenseres ind i hætten på opsamlingsrøret, og prøven lyseres ved pipettering op og ned i hætten i 1 min. Drej lyssætningen ned, og tilsæt 300 μL af lyse bufferen indeholdende β-mercaptoethanol i røret. Hvis flere hætter skal samles, skal du sørge for, at den totale mængde buffer er som anbefalet til RNA-ekstraktions sættet (tabel over materialer).
Forsigtig: der skal tilsættes β-mercaptoethanol for at beskytte RNA mod nedbrydning, men det anses for giftigt. Bær beskyttende tøj og handsker og arbejde i hætten. - For hvert lysbillede skal der desuden fremstilles et mærket 1,5 mL mikrocentrifuge glas med 350 μL af lysisbufferen indeholdende β-mercaptoethanol. Brug de resterende sektioner efter LCM'EN til at udtrække RNA. Separer forsigtigt filmen fra membranen og lysere prøven ved langsomt at pipettere lysis-bufferen på afsnittet flere gange.
Bemærk: Den totale mængde lyse buffer skal være 350 μL. Brug ikke det hele på én gang til fordøjelsen, da det vil flyde væk fra diaset. -
Sæt lysat prøverne på tøris og opbevar dem ved-80 °c.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Tø lysaterne på RT. Overfør lysaterne fra LCM-høstede celler fra opsamlings rørene til 1,5 mL mikrocentrifuge rørene. Hvis der blev brugt mere end én hætte til at høste prøven, pulje flere lysates.
- Ekstrakt RNA i henhold til producentens anvisninger. Behandl kolonner med DNase I for at fjerne genomisk DNA. Elute RNA med 14 μL RNase frit vand, hvilket resulterede i en 12 μL eluat. Opbevar RNA ved-80 °C.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
6. måling af RNA-udbytte og-integritet
- Tø RNA på våd is. Mål udbyttet og integriteten af isolerede RNA ved hjælp af mikro-kapillær elektroforese. Indlæs total RNA (1 μL pr. prøve) i en chip (tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En LCM-protokol blev udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til analyse af genekspression i knogleceller i muse femurs. I den optimerede protokol, 8 μm-tykke frosne knogle sektioner blev skåret på en selvklæbende film og plettet ved hjælp af en hurtig protokol til en kommerciel LCM frosne sektion bejdsen. Prøven blev klemt inde mellem PET-membranen og den selvklæbende folie. Mus knogleceller blev microdissekeret ved hjælp af en LCM system, der bruger tyngdekraften til prøveindsamling. En kolonne baseret RNA-ekstraktionsmetode blev brugt til at opnå et RNA af høj kvalitet med tilstrækkelig udbytte. Det isolerede RNA ' udbytte og integritet blev målt ved hjælp af mikro-kapillær elektroforese (figur 1).
Forskellen i RNA kvalitet og kvantitet opnået ved hjælp af forskellige lysis protokoller kan ses i den repræsentative gel og elektro pherograms. Da prøven blev lyseret ved pipettering op og ned i hætten i 1 min, var det muligt at isolere ca. 8,5 ng af RNA fra 1 mm2 microdissected knoglevæv (8 μm-tyk sektion). RIN-værdien var 8,60 (figur 2).
Alternativt blev LCM udført ved hjælp af et LCM-system, der bruger de-fokuserede laser Pulse, som katapulter materialet ind i overhæng ende klæbe hætte. RNA-kvalitet og-mængde kan estimeres i den repræsentative gel og elektro pherograms. For friske frosne knogler, det var muligt at isolere ca 1,6 ng af RNA fra 1 mm2 microdissected knoglevæv (8 μm-tyk sektion). RIN-værdien var 1 (figur 3).
Figur 1: rutediagram over laser opsamling microdissection-protokol for ferske frosne knogler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ gel (top) og elektro pherograms (bund) af RNA-prøver. LCM blev udført ved hjælp af et LCM-system, der bruger tyngdekraften til prøveindsamling. Der blev hentet RNA-prøver fra LCM-høstet væv (prøver 1, 3, 5, 7 og 9) og tilsvarende kontrol sektioner (henholdsvis prøve 2, 4, 6, 8 og 10). En RNA-prøve blev hentet fra kontrolsektionen, der var plettet, men ikke blev brugt til LCM (eksempel 11). Et samlet areal på 1 mm2 blev mikrodissekeret, og der blev anvendt forskellige lysis-protokoller. Prøve 1:350 μL af lysisbufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat i røret. Hætten blev lukket forsigtigt, og røret inverteret. LCM-høstede celler blev lyseres af vortexning 1 min, inkuberet ved rt for 10 min og vortexning 1 min. prøve 3:350 μl af lysisbufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat i opsamlingsrøret, hætten blev omhyggeligt lukket, og røret inverteret. LCM-høstede celler blev lyseres ved inkubering af opsamlings rørene på hovedet i 30 min ved rt. prøve 5:50 μl af lyse bufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat til hætten på opsamlingsrøret, og prøven blev lyseret ved pipettering op og ned i hætten i 1 min. Lysningen blev centrifugeret, og 300 μL af lyse bufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat til røret. Prøve 7:350 μL af lysisbufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat i røret. Hætten blev lukket forsigtigt, og røret inverteret. LCM-høstede celler blev lyseres af vortexning og invertering flere gange. Prøve 9:50 μL af lyse bufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat til hætten på opsamlingsrøret, og prøven blev lyseret ved inkubation i 5 minutter ved RT i hætten. Lysningen blev centrifugeret, og 300 μL af lyse bufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat til røret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentativ gel (top) og elektro pherograms (bund) af RNA-prøver. LCM blev udført ved hjælp af et LCM-system, der bruger de-fokuserede laser Pulse, som katapulter materialet ind i klæbe hætten placeret over afsnittet. RNA-prøver blev hentet fra LCM-høstet væv (prøver 5 og 6) og tilsvarende kontrol sektion (prøve 7). En RNA-prøve blev hentet fra kontrolsektionen, der var plettet, men ikke blev brugt til LCM (prøve 8). Et samlet areal på 0,5 mm2 eller 1 mm2 var mikrodissekeret (henholdsvis prøve 5 og 6). 350 μL af lysisbufferen indeholdende β-mercaptoethanol blev tilsat i opsamlingsrøret, hætten blev omhyggeligt lukket og røret inverteret. LCM-høstede celler blev lyseres ved inkuberende opsamlings rørene på hovedet i 30 min på rt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både RNA-kvalitet og-kvantitet kan påvirkes negativt i alle stadier af prøve præparatet, såsom vævs manipulation, LCM-proces og RNA-ekstraktion. Derfor blev en LCM-protokol udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til efterfølgende analyse af genekspression.
For LCM bruger de fleste laboratorier sektioner 7 − 8 μm tyk2. Tykkere sektioner ville tillade mere materiale, der skal høstes. Men hvis de er for tykke, kan dette reducere mikroskopisk opløsning og laseren kan ikke være i stand til at skære igennem. Det er sandsynligt, at optimal vævs tykkelse afhænger af LCM-systemet (og laser og slide type) anvendes, samt på vævet i spørgsmål8,25. I nærværende undersøgelse blev kryosektioner af forskellige tykkelser (4, 8 eller 12 μm) afprøvet; 8 μm-tykke sektioner fandtes at være ideelle til LCM, mens 12 μm knogle sektioner var sværere at skære med laseren og 4 μm sektioner gav lavere mængder af RNA.
Den endogene RNase aktivitet varierer mellem forskellige væv. Derfor kan farvningsprotokoller udviklet til væv med meget lav Rnaseaktivitet være uegnede for andre vævstyper. Nuclear fast Red26 og cresylacetat violet24 blev foreslået at være den bedste med hensyn til at bevare RNA integritet. Desuden var alkoholbaserede metoder overlegne i vandige pletter for at opretholde RNA-integriteten. De led imidlertid af en irreproducerbar farvnings intensitet27. Tid er en vigtig parameter at overveje. På den ene side er den tid, der kræves for at søge og identificere celler af interesse i sektionen, og til at udføre LCM ofte relativt lang. På den anden side er tid til rådighed for LCM begrænset, da, i nogle tilfælde, 20% RNA nedbrydning blev nået efter 30 min28. Derfor blev der anvendt forskellige metoder for at stabilisere RNA, såsom eksponering af sektioner for argon flux under microdissection28, eller brug af bufferet alkoholbaseret cresylacetat violet farvning og holde fugtighedsniveauet i laboratoriet lavt 27. Hertil kommer, at højst 15 min for microdissection trin blev foreslået2. I denne undersøgelse, frosne knogle sektioner blev plettet ved hjælp af en hurtig protokol til en kommerciel LCM plet, og selv efter 1 h ved RT, RIN værdier faldt fra 8,3 til 9,1. Derfor blev alle mikrodissektioner udført inden for mindre end 1 time efter farvning. Desuden blev der testet forskellige protokoller for farvning (med kortere inkubationer i vandige reagenser eller uden xylen-trinnet). Der blev ikke opnået nogen signifikant forbedring i RIN-værdierne.
I LCM-undersøgelser er to forskellige typer af RNA-ekstraktionsmetoder blevet sammenlignet: en fase adskillelses metode vs. en kolonne baseret metode. Det konstateredes, at RNA-ekstraktionsmetoden baseret på kolonner førte til bedre RNA-kvalitet og højere udbytte sammenlignet med fase separationsmetode8. I en anden undersøgelse resulterede et kommercielt kit, der bruger minimal fordøjelsestid og temperatur (5 min ved RT), i overlegen RNA-kvalitet sammenlignet med et RNA-isolations sæt, der har brug for længere fordøjelsestid ved højere temperatur (30 min ved 42 °C)7. I denne undersøgelse var det muligt at udtrække RNA af høj kvalitet (RIN > 8) af tilstrækkelig koncentration fra LCM-prøver ved hjælp af ferske frosne muse knogler og en kolonne baseret RNA-ekstraktionsmetode. Grundig lysis (1 min pipettering i hætten) er afgørende for god RNA-udbytte. Virkningen af RNA-ekstraktionsmetoden på RNA-udbyttet og integriteten opnået efter LCM blev undersøgt ved hjælp af flere forskellige RNA-isolations kits i henhold til producentens anvisninger. Men, bedre kvalitet RNAs og øget mængde blev opnået med det kit, der anvendes i den optimerede protokol. I pilot studiet blev der skåret i mikrodissekeret vævs områder på 1 mm2 endeområde, og det var muligt at isolere ca. 8,5 ng af RNAs med 8-μm-tykke knogle sektioner (ca. 800 PG/μl). Typisk blev osteoblaster, osteocytter og knogle forings celler fanget i 2 − 3 sektioner pr. prøve.
Der er knappe direkte sammenligninger mellem forskellige LCM-instrumenter. I en undersøgelse, to fælles LCM instrumenter blev testet, som afviger i den type laser, der anvendes (UV og infrarød [IR], henholdsvis) og metode til at fange væv (klæbende isolation Cap vs. caps belagt med gennemsigtig termoplastisk film, henholdsvis). Det konstateredes, at det infrarøde system resulterede i beskedent højere RNA-kvalitet7for tyndt udskåret fersk frosset musehjerne sektioner. I nærværende undersøgelse blev to LCM-systemer, der muliggør kontaktfri prøveindsamling, sammenlignet. I et system, den mikrodissekeret prøve falder tyngdekraften i hætten placeret lige under29. Et andet system bruger en de-fokuseret laser puls, som katapulter materialet ind i overhængende Cap30. For ferske frosne knogler blev der opnået højere RNA-mængder og RIN-værdier, når tyngdekraften blev anvendt til vævs opsamling. Desuden er katapulting-teknologien ikke kompatibel med "sandwich", der består af Klæbefolie, Cryo-sektion, og PET-membran, på grund af den ekstra vægt af PET-membranen.
LCM kræver fysisk adgang til vævsoverfladen. Derfor er montering og Glasbelægning af prøven uanvendelig, med konsekvens af nedsat visualisering af morfologi. For at overvinde denne begrænsning blev der udviklet et væske dækmedium31. Alternativt kan 10 − 15 μL ethanol tilsættes direkte på vævs afsnittet, hvilket muliggør bedre morfologiske analyser før fordampning2. I denne undersøgelse blev frosne knogle sektioner skåret på en klæbende film, og før prøven fik lov til at tørre helt, blev den klemt mellem PET-membranen og filmen. Denne "sandwich" metode gav god morfologiske kontrast og specifikke knogleceller blev klart identificeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ute Zeitz og Nikole ginner for deres fremragende tekniske hjælp såvel som Vetcore og Animal Care personale for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
