Summary
레이저 포획 미세해부(LCM) 프로토콜은 골세포의 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위해 개발되었다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 임의의 경조직의 세포에서 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.
Abstract
RNA 수율 및 무결성은 RNA 분석에 결정적입니다. 그러나, 전체 레이저 포획 미세 해부 (LCM) 절차를 통해 RNA 무결성을 유지하는 것은 종종 기술적으로 도전적이다. LCM 연구는 낮은 양의 물질로 작동하기 때문에 제한된 RNA 수율에 대한 우려도 중요합니다. 따라서, LCM 프로토콜은 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위하여 개발되었다. 염색 프로토콜, 저온절의 두께, 미세 해부된 조직 수량, RNA 추출 키트 및 미세 해부된 골세포로부터 얻어진 RNA 수율 및 무결성에 사용되는 LCM 시스템의 효과를 평가하였다. 8 μm 두께의 냉동 뼈 섹션은 점착필름을 사용하여 만들어졌고 상업적인 LCM 얼룩에 대한 신속한 프로토콜을 사용하여 염색되었다. 샘플을 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인과 접착제 막 사이에 끼워 넣은 것이다. 샘플 수집및 컬럼 기반 RNA 추출 방법에 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 충분한 수율의 고품질 RNA를 획득했습니다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 생리적 조건 및 질병 과정 모두에서 임의의 경조직의 세포에서 의학적 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.
Introduction
조직은 이기종적이고 공간적으로 분포된 세포 유형으로 구성됩니다. 주어진 조직에 있는 다른 세포 모형은 동일 신호에 다르게 반응할 수 있습니다. 따라서, 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 상이한 세포 유형의 역할을 평가하기 위해 특정 세포 집단을 분리할 수 있는 것이 필수적이다. 레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 복잡한 조직1에서지정된 세포를 분리하고 제거하는 비교적 빠르고 정확한 방법을 제공합니다. LCM 시스템은 레이저 빔의 힘을 사용하여 세포가 조직학적 조직 섹션에서 관심 있는 세포를 분비처리하거나 배양성장을 할 필요 없이 분리합니다. 이것은 세포가 그들의 자연적인 조직 서식지에 있고, 다른 세포 사이 공간 관계를 포함하는 조직 건축이 유지된다는 것을 의미합니다. 포획된 세포와 잔류 조직의 형태는 잘 보존되고, 여러 조직 성분은 동일한 슬라이드로부터 순차적으로 샘플링될 수 있다. 단리된 세포는 그들의 RNA, DNA, 단백질 또는 대사산물함량2,3의후속 분석을 위해 사용될 수 있다.
상이한 세포 집단에서 유전자 발현을 분석하기 위해, 또는 상이한 치료 후, 후속 분석4,5에대한 충분한 품질 및 수량의 mRNAs를 얻을 필요가 있다. DNA와 는 대조적으로, RNA는 고정에 더 민감하고 목적이 RNA를 공부하는 때 동결 조직의 사용은 추천됩니다. mRNA는 유비쿼터스 리보누클러(RNase)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 시편 처리 및 준비 중 엄격한 RNase 프리 조건이 필요하며 실온에서 시료를 보관하지 않는 것이 필요합니다. 또한, 어떤 장기간 수성 위상 단계없이 빠른 기술은 RNA 저하를 방지하기 위해 중요하다6. RNA 수율 및 무결성은 또한 LCM 공정 및 LCM 시스템 사용7,8에의해 영향을 받을 수 있다. 현재, 다른 작동 원리를 가진 4개의 LCM 시스템을 사용할 수 있습니다2. RNA 추출 방법은 다른 RNA 격리 키트가 RNA 수량 및 품질7,8에서유의한 차이로 테스트되었기 때문에 중요 할 수 있습니다.
모든 조직 준비 방법은 좋은 형태학적 대비를 얻고 추가 분석을 위한 RNA 무결성을 유지하는 것 사이에서 균형을 찾아야 합니다. 뼈에서 냉동 섹션을 준비하기 위해 접착제 필름이 개발되어지속적으로 개선 9. 뼈 부분은 접착제 필름에 직접 절단되고 염색됩니다. 이 접착제 필름은 많은 유형의 염색에 적용 가능하며 LCM9,10,11,12,13을사용하여 뼈 저온절로부터 관심 있는 세포를 분리하는 데 사용될 수 있습니다. 14. 외과 제거, 포함, 동결, 절단 및 염색을 포함한 모든 단계는 1 시간 이내에 완료 할 수 있습니다. 중요한 것은, 골아세포, 골라선 세포 및 파골세포와 같은 세포는9,10,11, 12,13,14를명확하게 식별할 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하다는 장점이 있습니다. 뼈 저온 절을 생성하는 다른 방법은 테이프 전달시스템(15)을사용하는 것이다. 그러나 후자의 기술은 시간이 더 많이 걸리고 추가계측이 필요하며, 접착 테이프에서 자외선(UV) 가교에 의한 사전 코팅된 멤브레인 슬라이드로 섹션을 옮겨야 하기 때문에 추가적인 계측이 필요합니다. 테이프 전달 시스템은 LCM16, 17,18,19와성공적으로 결합되었지만, 가교 코팅이 배경 패턴을 만들 수 있다는 점에 유의해야 한다. 세포형식별(20)을방해할 수 있다.
전형적으로, 소량의 RNA만이 미세 해부세포로부터 추출되고, RNA의 질 및 양은 종종 마이크로 모세관전기영동21에의해 평가된다. 컴퓨터 프로그램은 RNA 무결성 번호(RIN)라고 하는 RNA 추출물에 품질 지수를 할당하는 데 사용됩니다. RIN 값이 1.0이면 완전히 분해된 RNA를 나타내지만 10.0의 값은 RNA가 완전히 손상되지않은 22임을나타냅니다. 일반적으로 5 이상의 인덱스는 RNA 연구에 충분하다고 간주됩니다. RIN 값이 5.0-10.0인 샘플에서 유전자 발현 패턴은 서로 잘 상관관계가 있는 것으로 보고되었다23. 이 방법의 민감도는 높지만 총 RNA의 50 pg/μL이 검출될 수 있기 때문에 시료의 RNA 농도가 매우 낮으면 품질 평가를 얻기가 매우 어려울 수 있습니다. 따라서, RNA 품질을 평가하기 위해, LCM 후 잔류하는 조직 섹션은 종종 RNA를 추출하는 데 사용되며,슬라이드(24)에버퍼를 피펫팅하여 사용된다.
LCM은 다른 냉동 조직에 광범위하게 사용되었지만 추출 된 RNA의 RIN 값은 거의보고되지 않습니다. 게다가, 마우스 뼈에 있는 RNA를 공부하는 가장 적당한 방법을 명확히 하기 위하여 비교 연구 결과가 없습니다. 본 연구에서, 성인 마우스 대퇴골로부터의 냉동 단면은 고품질 RNA를 얻기 위하여 샘플 준비, LCM 프로토콜 및 RNA 추출을 최적화하기 위하여 이용되었다. 본 프로토콜은 샘플 수집을 위해 중력을 사용하는 LCM 시스템에 특히 최적화되었습니다.
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Protocol
마우스의 뼈 조직은 동물 관리에 대한 일반적인 지침에 따라 엄격하게 사용되었으며 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 동물 및 동결 포함
- 일정한 실내 온도 (RT; 24 °C)와 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 12 시간 암흑 주기의 조건에서 동물을 집.
참고: 본 연구에서 뼈 조직은 3 개월 된 남성 야생 형 C57BL / 6 마우스로부터 수득하였다. - 부검에서, 전신 마취하에 복부 정맥 카바에서 생쥐를 추방합니다 (케타민 / 자일라진, 100/6 mg / kg 복강 내).
참고: RNA 분해를 방지하기 위해 RNase가 없는 기기와 재료를 사용하고 장갑을 착용하고 전체 실험 전반에 걸쳐 RT에서 시료를 신속하게 보관하지 않도록 하십시오. - 대퇴골 전체를 빠르게 제거하고 메스와 종이 타월을 사용하여 주변 연조직을 청소하십시오. 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물을 임베딩 몰드에 붓고 대퇴골을 임베딩 몰드의 바닥에 넣습니다. 액체 질소에서 샘플을 스냅 동결. OCT는 RT에서 투명하고 동결되면 흰색입니다.
- 완전히 얼린 후, 시료를 호일에 싸서 드라이 아이스에 -80°C로 옮김. 추가 처리가 될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
2. 섹션 준비
- 저온 극저온 내의 온도를 -19°C로 설정하고 블록 홀더의 온도를 -17°C로 설정합니다. 70% 에탄올을 사용하여 저온 극저온 내부를 닦으소. 일회용 블레이드를 단단한 조직, 유리 슬라이드 및 피팅 도구를 저온 유지 에 넣고 식힙니다. 단면 화 동안 저온 유지 에 보관하십시오.
- 냉동 얼음에 얼어 붙은 조직 블록을 저온 극저온으로 옮기고 적어도 10 분 동안 평형화하십시오.
참고: 냉동 절편을 위해 -80 °C에서 -19 °C까지 한 블록의 반복적인 해동 및 빈번한 사이클링을 피하십시오. - 임베딩 몰드의 바닥을 눌러 OCT 블록을 몰드밖으로 밀어내십시오. 블록 홀더에 충분한 OCT 매체를 적용하여 블록을 부착합니다. OCT 매체가 완전히 동결될 때까지 기다립니다.
- 블록 홀더를 오브젝트 홀더에 놓고 제자리에 조입니다. 블레이드 위치를 조정하고 샘플을 덮는 OCT를 제거하기 위해 15 μm 절단 증분을 사용하여 블록을 다듬습니다. 시료가 더 일찍 절단되고 표면이 공기에 노출된 경우, 블록에서 첫 번째 2−3 조직 섹션을 폐기하십시오.
- 저온 장치를 조정하여 8 μm 섹션을 생성하고 폐기될 2−3 극저온 절을 잘라냅니다(처음 몇 개는 일반적으로 8 μm보다 두껍습니다). 블록에 접착제 필름을 놓고 피팅 도구를 사용하여 필름을 블록에 부착합니다. 필름에 의해 섹션을 잡고 천천히 일정한 속도로 컷을 합니다.
- 시료의 해동을 피하기 위해 미리 냉각된 유리 슬라이드(저온 유지근 내의 저온 막에) 필름(샘플을 위로 향하게)을 놓습니다. 테이프를 사용하여 필름을 유리 슬라이드에 고정하여 얼룩을 쉽게 합니다. 염색 프로토콜을 즉시 진행합니다.
3. 빠른 염색 프로토콜
- 50 mL 튜브에 다음 용액 40 mL을 준비하고 얼음에 넣어 : 95 % 에탄올, RNase- 불물, 100 % 에탄올, 100 % 에탄올 과 100 % 자일렌. 얼음에 모든 단계를 수행 (얼룩 제외). 각 실험일마다 RNase가 없는 물로 모든 수성 시약을 신선하게 준비하십시오.
주의 사항: 실렌에 의한 중독을 피하기 위해 후드에서 작업하십시오. - 95% 에탄올에서 30s의 섹션을 배양한 다음 RNase가 없는 물에 30s 섹션을 찍어 LCM 및 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있는 OCT를 신중하고 완전하게 제거합니다.
- 상업용 LCM 냉동 섹션얼룩(재료 표)의50 μL을 섹션에 분배하고 RT에서 10초 동안 배양하고 슬라이드의 가장자리를 흡수성 티슈 페이퍼에 놓음으로써 배수합니다. 100% 에탄올로 30s를 헹구어 여분의 얼룩을 제거합니다.
- 30초에 100% 에탄올로 두 번째 튜브에 뼈 부분을 담그고 30초 동안 100% 자일렌으로 옮김을 옮니다.
- 접착제 필름(샘플을 위로 향하여)을 드라이 글래스 슬라이드에 지지체로 넣습니다. 필름이 영향을 받지 않고 가능한 한 평평하게 배치되지 않도록 주의하십시오. 시료가 완전히 마르지 않도록 하십시오.
- PET 멤브레인 프레임 슬라이드를 놓습니다. 곧 멤브레인에 장갑을 낀 손가락을 눌러 필름에 부착하십시오. 샘플은 멤브레인과 점착 막 사이에 끼어 있습니다. 접착필름은 접히거나 구겨져서는 안 되며 필름과 멤브레인 사이에 기포가 없어야 합니다. LCM을 즉시 진행합니다.
4. 레이저 캡처 미세 해부
- 표면 데톤타미넌트(재료 표)를 사용하여 RNase에서 스테이지와 캡홀더를청소합니다. 슬라이드 홀더와 캡 홀더에 각각 슬라이드와 캡을 로드합니다.
- 초점을 조정하고 1.25배 의 목표로 슬라이드 개요를 획득합니다. 40x 목표로 변경하고 초점을 조정합니다. 슬라이드 개요를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 다음과 같이 레이저 매개 변수를 조정 : 조리개, 7; 레이저 전원, 60; 속도, 5; 펄스 주파수, 201; 표본 균형, 20. 각 목표에 대해 이러한 매개 변수를 최적화합니다.
- 레이저가 샘플을 절단하지 못하면 레이저 파워를 높입니다. 대안적으로, 레이저는 두 번 이상 적용될 수 있다. 또한, 불완전한 컷의 지점에 대한 대상을 검사하고 이동 및 절단 옵션을 사용하여 이러한 지점에서 선을 다시 그렸다. 후속 슬라이드의 해부를 위해 레이저 설정을 저장합니다.
- 형태학적 기준에 따라 말단 대퇴 부설 또는 피질 뼈에서 골아세포, 골세포 및 뼈 라이닝 세포를 선택하십시오. UV 레이저에 의한 손상을 최소화하기 위해 대상 셀에서 멀리 떨어진 레이저 경로에 대한 선을 그립니다. 염색 후 1시간 이내에 모든 미세 절제술을 수행합니다.
- 0.5 mL 튜브의 별도 캡에 각 세포 유형을 수집합니다.
참고: 액체 회수 대신 건조 포착은 RNA 분해를 피할 수 있습니다. 또한, 미세원심지 튜브의 캡에 포함된 매우 적은 양의 버퍼는 LCM 동안 증발 또는 결정화(그 조성에 따라 다름)할 수 있다. - 해당되는 경우 LCM 후 의 수집 튜브 캡을 관찰하여 캡처 성공을 확인합니다. RNA 추출을 즉시 진행하십시오.
5. RNA 추출
- β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충액의 50 μL을 수집 튜브의 캡에 넣고 캡에서 1분 동안 상하로 파이펫팅하여 샘플을 용해시합니다. 여러 대문자가 풀링될 경우 RNA 추출키트(재료 표)에대해 총 버퍼 부피가 권장되는지 주의하십시오.
주의: β-메르카포에탄올은 RNA의 분해를 막기 위해 첨가되어야 하지만 독성으로 간주됩니다. 보호복과 장갑을 착용하고 후드에서 작업하십시오. - 또한, 각 슬라이드에 β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충액의 350 μL로 1.5 mL 마이크로원절튜브를 준비한다. RNA를 추출하기 위해 LCM 후 남은 섹션을 사용하십시오. 조심스럽게 막에서 필름을 분리하고 천천히 섹션에 여러 번 포염 버퍼를 피펫하여 샘플을 lyse.
참고: 라시스 버퍼의 총량은 350 μL이어야 한다. 슬라이드에서 흘러 나오기 때문에 소화를 위해 한 번에 모든 것을 사용하지 마십시오. -
용해 시료를 드라이 아이스에 넣고 -80°C에 보관합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - RT. 수집 튜브에서 LCM 수확 세포에서 1.5 mL 미세 원심 분리지 튜브로 용해액을 채취하십시오. 샘플을 수확하기 위해 두 개 이상의 캡을 사용한 경우 여러 개의 용해를 풀합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출하십시오. 게놈 DNA를 제거하기 위해 DNase I로 컬럼을 치료하십시오. 14 μL의 RNase-free 물로 RNA를 용출하여 12 μL 용출액을 생성합니다. RNA를 -80°C에서 저장합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
6. RNA 수율 및 무결성 측정
- 젖은 얼음에 RNA를 해동. 미세 모세관 전기 영동을 사용하여 분리 된 RNA의 수율과 무결성을 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA(샘플당 1μL)를칩(재료 표)에로드합니다.
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Representative Results
마우스 대퇴골의 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위해 LCM 프로토콜이 개발되었다. 최적화된 프로토콜에서, 8 μm 두께의 냉동 골 절편을 점착필름상에 절단하고 상업적인 LCM 냉동 단면 얼룩에 대한 신속한 프로토콜을 사용하여 염색시켰다. 샘플을 PET 멤브레인과 접착제 필름 사이에 끼웠습니다. 마우스 뼈 세포는 샘플 수집을 위해 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 미세 해부되었습니다. 컬럼 기반 RNA 추출 방법은 충분한 수율의 고품질 RNA를 얻기 위해 사용되었다. 단리된 RNA의 수율 및 무결성은 미세 모세관 전기영동을 사용하여 측정하였다(도1).
상이한 용해 프로토콜을 사용하여 얻은 RNA 품질 및 수량의 차이는 대표적인 겔 및 전기 전형체에서 확인할 수 있다. 시료를 캡에서 1분 동안 상하로 파이펫팅하여 용해시켰을 때, 1 mm2 마이크로제분부한 뼈 조직(8 μm 두께)으로부터 약 8.5 ng의 RNA를 분리할 수 있었다. RIN 값은 8.60(그림2)이었다.
또는 LCM은 점착 캡에 재료를 투석시키는 데 초점을 맞춘 레이저 펄스를 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행되었습니다. RNA 품질 및 양은 대표적인 겔 및 전기포로그램에서 추정될 수 있다. 신선한 냉동 뼈의 경우, 1 mm2 미세 해부 된 뼈 조직 (8 μm 두께 의 부분)에서 약 1.6 ng의 RNA를 분리 할 수 있었습니다. RIN 값은1(그림3)이었습니다.
그림 1: 새로 얼어붙은 뼈에 대한 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RNA 샘플의 대표적인 겔(상부) 및 전기 전형체(아래). LCM은 샘플 수집을 위해 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행되었습니다. RNA 샘플을 LCM 수확 조직(샘플 1, 3, 5, 7 및 9) 및 해당 대조군 섹션(샘플 2, 4, 6, 8 및 10)으로부터 각각 회수하였다. 1개의 RNA 샘플은 염색되었지만 LCM(샘플 11)에 사용되지 않은 대조군 섹션에서 회수되었다. 1mm2의 총 면적을 미세 해부하고, 상이한 용해 프로토콜을 사용했습니다. 샘플 1: β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 350 μL을 튜브 내로 첨가하였다. 뚜껑을 조심스럽게 닫았고 튜브가 뒤집혔습니다. LCM 수확된 세포를 1분간 와류로 용해시키고, RT에서 10분 동안 배양하고, 1분 동안 배양하고, 1분 동안 바랄링 1분. 샘플 3: β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 350 μL을 수집 튜브에 첨가하고, 캡을 조심스럽게 닫고, 튜브를 반전시켰다. LCM 수확 된 세포는 RT. 샘플 5에서 30 분 동안 거꾸로 수집 튜브를 인큐베이팅하여 용해시켰다: β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 50 μL을 수집 튜브의 캡에 첨가하고 샘플을 캡에서 상하로 파이펫팅하여 1 분 동안 용해시켰다. 용해염을 원심분리하고 β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 300 μL을 튜브 내로 첨가하였다. 샘플 7: β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 350 μL을 튜브 내로 첨가하였다. 뚜껑을 조심스럽게 닫았고 튜브가 뒤집혔습니다. LCM 수확된 세포는 여러 번 소용돌이 및 반전하여 용해시켰다. 샘플 9: β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 50 μL을 수집 튜브의 캡에 첨가하고, 샘플을 캡내의 RT에서 5분 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. 용해염을 원심분리하고, β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 300 μL을 튜브에 첨가하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNA 샘플의 대표적인 겔(상부) 및 전기 전형체(아래). LCM은 디포커스 레이저 펄스를 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행되었으며, 이 시스템은 단면 위에 위치한 점착 캡에 물질을 투석합니다. RNA 샘플을 LCM 수확 조직(샘플 5 및 6) 및 해당 대조군 부(샘플 7)로부터 회수하였다. 1개의 RNA 샘플은 염색되었지만 LCM용으로 사용되지 않은 대조군 부로부터 회수되었다(샘플 8). 0.5 mm2 또는 1 mm2의 총 면적을 미세 하해하였다(각각 샘플 5 및 6). 350 μL의 β-메르카포에탄올을 함유하는 용해 완충제의 수집 튜브에 첨가하였고, 캡을 조심스럽게 닫고 튜브를 반전시켰다. LCM 수확 된 세포는 RT에서 30 분 동안 거꾸로 수집 튜브를 인큐베이팅하여 용해시켰습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
RNA 질 및 양은 조직 조작, LCM 프로세스 및 RNA 추출과 같은 견본 준비의 모든 단계에서 부정적으로 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 후속 유전자 발현 분석을 위한 충분한 양의 고품질 RNA를 얻기 위해 LCM 프로토콜이 개발되었다.
LCM의 경우 대부분의 실험실에서는 7−8 μm두께의 2섹션을 사용합니다. 두꺼운 섹션은 더 많은 재료를 수확 할 수 있습니다. 그러나, 그들은 너무 두꺼운 경우, 이 현미경 해상도 줄일 수 있습니다 및 레이저를 통해 절단 하지 못할 수 있습니다. 최적의 조직 두께는 LCM 시스템 (및 레이저 및 슬라이드 유형)뿐만 아니라 문제8,25의조직에 따라 달라질 수 있습니다. 본 연구에서, 상이한 두께의 저온절절(4, 8 또는 12 μm)을 시험하였다; 8 μm 두께의 섹션은 LCM에 이상적인 것으로 나타났으며, 12 μm 뼈 섹션은 레이저로 절단하기가 더 어려웠고 4 μm 섹션은 더 적은 양의 RNA를 주었다.
내 인 성 RNase 활동 다른 조직 사이 변화. 따라서, 매우 낮은 RNase 활성을 가진 조직을 위해 개발된 염색 프로토콜은 그밖 조직 모형을 위해 부적당할 수 있었습니다. 핵고속적빨색(26) 및 크레실바이올렛(24)은 RNA 무결성을 보존하는 측면에서 최고로 제안되었다. 또한, 알코올 계 방법은 RNA 무결성을 유지하기 위한 수성 얼룩보다 우수했다. 그러나, 그들은 재현 할 수없는 염색 강도27로고통. 시간은 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 한편, 섹션에서 관심 있는 세포를 검색하고 식별하는 데 필요한 시간은 LCM을 수행하는 데 비교적 긴 경우가 많다. 한편, LCM에 사용할 수 있는 시간은 제한되며, 어떤 경우에는 30분28분후에 20% RNA 분해에 도달하였다. 따라서,마이크로분면(28)동안 아르곤 플럭스에 대한 절편노출, 또는 완충알코올계 크레실바이올렛 염색 및 실험실내 습도 수준을 낮게 유지하는 등의 RNA를 안정화시키기 위해 다양한 방법이 적용되었다. 27. 또한, 미세 해부 단계에 대한 최대 15 분2를제안했다. 본 연구에서, 냉동 된 뼈 섹션 상업적인 LCM 얼룩에 대 한 빠른 프로토콜을 사용 하 여 염색 했다, 그리고 후에도 1 RT에서 시간, RIN 값 감소 8.3 받는 9.1. 따라서, 모든 미세 절제술은 염색 후 1시간 이내에 수행되었다. 또한, 염색을 위한 상이한 프로토콜을 시험하였다(수성 시약에서 또는 자일렌 단계 없이 짧은 배양). RIN 값의 현저한 개선은 달성되지 않았습니다.
LCM 연구에서, 두 가지 유형의 RNA 추출 방법을 비교했습니다: 상 분리 방법 대 컬럼 기반 방법. 컬럼에 기초한 RNA 추출 방법은 상 분리 방법8에비해 RNA 품질이 더 좋고 수율이 높다는 것을 알 수 있었다. 또 다른 연구에서는, 최소한의 소화 시간과 온도(RT에서 5분)를 사용하는 상용 키트는 더 높은 온도(42°C에서 30분)에서 더 긴 소화 시간을 필요로 하는 RNA 격리 키트에 비해 우수한 RNA 품질을 초래했습니다7. 본 연구에서는, 신선 냉동 마우스 뼈 및 컬럼 기반 RNA 추출 방법을 사용하여 LCM 샘플로부터 충분한 농도의 고품질 RNA(RIN > 8)를 추출할 수 있었다. 철저한 용해 (캡에 1 분 파이펫팅)는 좋은 RNA 수율에 필수적입니다. LCM 후 얻어진 RNA 수율 및 무결성에 대한 RNA 추출 방법의 효과는 제조사의 지침에 따라 여러 가지 RNA 절연 키트를 사용하여 조사하였다. 그러나 최적화된 프로토콜에 사용되는 키트를 사용하여 더 나은 품질의 RNA 및 증가된 양을 얻을 수 있었습니다. 파일럿 연구에서, 1 mm2 최종 영역의 미세 해부 조직 영역을 절단하고, 8-μm 두께의 뼈 섹션 (약 800 pg / μL)을 사용하여 RNA의 약 8.5 ng를 분리 할 수 있었다. 전형적으로, 조골 세포, 골세포 및 뼈 안감 세포는 견본 당 2-3 단면도에서 붙잡혔습니다.
다른 LCM 계측기 간의 직접 비교는 거의 없습니다. 한 연구에서는 두 개의 일반적인 LCM 계측기(각각 UV 및 적외선[IR]))와 조직 캡처 방법(투명 열가소성 필름으로 코팅된 접착제 절연 캡 대 캡)의 종류가 다른 두 개의 일반적인 LCM 계측기검사를 거쳤습니다. 그것은 얇게 절제 된 신선한 냉동 마우스 뇌 섹션에 대 한 발견, IR 시스템 겸손 하 게 더 높은 RNA 품질 결과7. 본 연구에서는 비접촉식 샘플 수집을 허용하는 두 개의 LCM 시스템을 비교했습니다. 한 시스템에서, 미세 해부 된 샘플은29바로 아래에 배치 된 캡에 중력에 의해 떨어진다. 또 다른 시스템은 돌출 캡(30)에재료를 투석기 de-focused 레이저 펄스를 사용합니다. 신선한 냉동 된 뼈에 대 한, 더 높은 RNA 금액 및 RIN 값 중력 조직 캡처에 사용 될 때 얻은. 또한, 촉매 기술은 PET 멤브레인의 추가 중량으로 인해 접착제 필름, 저온 섹션 및 PET 멤브레인으로 구성된 "샌드위치"와 호환되지 않습니다.
LCM은 조직 표면에 물리적 인 접근을 요구합니다. 따라서 시편의 장착 및 유리 덮개는 형태학의 시각화 가증의 결과로 적용되지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유체 커버배지(31)가개발되었다. 또는 10−15 μL의 에탄올을 조직 섹션에 직접 첨가할 수 있으므로 증발 전 보다 나은 형태학적 분석이 가능합니다2. 본 연구에서, 동결된 뼈 절편을 접착제 막상에서 절단하고, 시료가 완전히 건조되기 전에, PET 멤브레인과 필름 사이에 끼어 넣었다. 이 "샌드위치" 방법은 좋은 형태학적 대비를 주었고 특정 뼈 세포는 명확하게 확인되었다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 우테 자이츠와 니콜 지너가 뛰어난 기술적 도움과 수의사 코어 및 동물 관리 직원에게 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
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