Formålet med denne protokol er at fremkalde forbigående in vivo-produktion af ikke-dødelige niveauer af reaktive iltarter (ROS) i musehud, hvilket yderligere fremmer fysiologiske reaktioner i vævet.
Her beskriver vi en protokol til at inducere omskiftelig in vivo fotogenerering af endogene reaktive iltarter (ROS) i musehud. Denne forbigående produktion af ROS in situ aktiverer effektivt celleproliferation i stamcellenicher og stimulerer vævsregenerering som stærkt manifesteret gennem acceleration af brandheling og hårfollikelvækstprocesser. Protokollen er baseret på en regulerbar fotodynamisk behandling, der behandler vævet med forstadier til det endogene fotosensibilisator protoporphyrin IX og yderligere bestråler vævet med rødt lys under tæt kontrollerede fysisk-kemiske parametre. Samlet set udgør denne protokol et interessant eksperimentelt værktøj til at analysere ROS-biologi.
Reaktive iltarter (ROS) er resultatet af den kemiske reduktion af molekylært ilt til dannelse af vand og inkluderer singlet oxygen, superoxidanion, hydrogenperoxid og hydroxylradikalet 1,2,3. ROS har en meget kort levetid på grund af deres ekstremt kemiske reaktive natur. I aerobe organismer dannes ROS tilfældigvis inde i cellerne som et stort utæt biprodukt af aerob respiration (elektrontransportkæde) i mitokondrierne. Forbigående akkumulering af høje niveauer af ROS i cellen resulterer i en oxidativ stresstilstand, der kan fremkalde irreversibel inaktivering af proteiner, lipider og sukkerarter og introduktion af mutationer i DNA-molekylet 2,3,4,5. Den gradvise akkumulering af oxidativ skade i celler, væv og hele organismer stiger støt med tiden og har været forbundet med induktion af celledødsprogrammer, flere patologier og aldringsprocessen 2,3,4,6.
Aerobe organismer har støt udviklet effektive molekylære mekanismer til at tackle overskydende ROS-akkumulering i celler og væv. Disse mekanismer omfatter medlemmer af superoxiddismutase (SOD) proteinfamilien, som katalyserer superoxidradikal dismutation til molekylært ilt og hydrogenperoxid, samt forskellige katalaser og peroxidaser, der bruger antioxidantpuljen (glutathion, NADPH, peroxiredoxin, thioredoxin 7,8) til at katalysere den efterfølgende omdannelse af hydrogenperoxid til vand og molekylært oxygen.
Imidlertid understøtter flere rapporter ROS’s rolle som nøglekomponenter i molekylære kredsløb, der regulerer kritiske cellefunktioner, herunder spredning, differentiering og mobilitet 2,3,4. Dette koncept understøttes yderligere af den indledende identifikation og karakterisering af dedikerede ROS-producerende mekanismer i aerobe organismer, herunder lipoxygenaser cyclooxygenaser og NADPH-oxidaser 9,10. I denne forstand udviser ROS en aktiv rolle under hvirveldyrs embryoudvikling 11,12,13, og nøgleroller for disse molekyler i reguleringen af specifikke in vivo fysiologiske funktioner er blevet rapporteret i forskellige eksperimentelle systemer, herunder differentieringsprogrammet for hæmatopoietiske forfædre i Drosophila14, helbredende induktion i zebrafisk eller haleregenerering i Xenopus haletudser 15. Hos pattedyr har ROS været involveret i neurale stamcellers selvfornyelse/differentieringspotentiale i en neurosfæremodel16 og i dereguleringen af tarmens stamcellefunktion under initiering af kolorektal cancer17. I huden har ROS-signalering været forbundet med epidermal differentiering og regulering af hudens stamcelleniche og hårsækkens vækstcyklus18,19.
I dette perspektiv er en væsentlig eksperimentel begrænsning for at bestemme ROS’s fysiologiske roller i biologiske systemer, både under normale eller patologiske forhold, manglen på tilstrækkelige eksperimentelle værktøjer til at inducere kontrolleret produktion af disse molekyler i celler og væv, der nøjagtigt ligner deres fysiologiske produktion som anden signalbudbringer. På nuværende tidspunkt involverer de fleste eksperimentelle tilgange administration af eksogen ROS, hovedsagelig i form af hydrogenperoxid. Vi har for nylig implementeret en eksperimentel tilgang til at tænde for en forbigående, ikke-dødelig in vivo-produktion af endogen ROS i musehuden baseret på administration af forstadier til det endogene fotosensibilisator protoporphyrin IX (PpIX; f.eks. aminolaevulinsyre eller dets methylderivat methylaminolevulinat) og yderligere bestråling af prøven med rødt lys for at inducere in situ-dannelse af ROS fra intracellulært molekylært ilt (figur 1). Denne fotodynamiske procedure kan effektivt anvendes til at stimulere residente stamcellenicher og dermed aktivere vævets regenerative programmer19,20 og åbne vejen for nye terapeutiske modaliteter inden for hudregenerativ medicin. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af protokollen, der viser repræsentative eksempler på stimulering af stamcellenicher, målt som en stigning i antallet af langsigtede 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) etiketfastholdende celler (LRC’er) i udbulningsområdet i hårsækken19,21 og efterfølgende aktivering af regenereringsprogrammer (acceleration af hårvækst og brandhelingsprocesser) induceret af forbigående, ikke-dødelig ROS-produktion i huden på C57Bl6-musestammen.
Her præsenterer vi en metode, der tillader en forbigående aktivering af endogen ROS-produktion in vivo i musehud med fysiologiske virkninger. Metoden er baseret på en fotodynamisk procedure til at inducere en kontrolleret og lokal stimulering af det endogene fotosensibilisator PpIX (figur 1B). Denne eksperimentelle tilgang er et interessant værktøj til at studere ROS-biologi i in vivo-eksperimentelle systemer, der udgør et betydeligt fremskridt i forhold til metoder, der bruger ekstern…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er blevet støttet af tilskud fra Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 til JE) og Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 til JE) i Spanien. EF er blevet støttet af Atracción de Talento Investigador-tilskuddet 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid og UAM).
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |