Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Summary

Lo scopo di questo protocollo è quello di indurre la produzione transitoria in vivo di livelli non letali di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nella pelle del topo, promuovendo ulteriormente le risposte fisiologiche nel tessuto.

Abstract

Qui, descriviamo un protocollo per indurre la fotogenerazione commutabile in vivo di specie reattive dell’ossigeno endogene (ROS) nella pelle del topo. Questa produzione transitoria di ROS in situ attiva in modo efficiente la proliferazione cellulare nelle nicchie delle cellule staminali e stimola la rigenerazione dei tessuti come fortemente manifestato attraverso l’accelerazione della guarigione delle ustioni e dei processi di crescita del follicolo pilifero. Il protocollo si basa su un trattamento fotodinamico regolabile che tratta il tessuto con precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX e irradia ulteriormente il tessuto con luce rossa sotto parametri fisico-chimici strettamente controllati. Nel complesso, questo protocollo costituisce un interessante strumento sperimentale per analizzare la biologia dei ROS.

Introduction

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono il risultato della riduzione chimica dell’ossigeno molecolare per formare acqua e includono ossigeno singoletto, anione superossido, perossido di idrogeno e il radicale ossidrile ^1,2,3. I ROS hanno una durata molto breve a causa della loro natura estremamente reattiva chimica. Negli organismi aerobici, i ROS si formano incidentalmente all’interno delle cellule come un importante sottoprodotto della respirazione aerobica (catena di trasporto degli elettroni) nei mitocondri. L’accumulo transitorio di alti livelli di ROS nella cellula provoca una condizione di stress ossidativo che può provocare l’inattivazione irreversibile di proteine, lipidi e zuccheri e l’introduzione di mutazioni nella molecola di DNA 2,3,4,5. Il graduale accumulo di danno ossidativo nelle cellule, nei tessuti e negli organismi interi aumenta costantemente con il tempo ed è stato associato all’induzione di programmi di morte cellulare, diverse patologie e il processo di invecchiamento 2,3,4,6.

Gli organismi aerobici hanno costantemente sviluppato meccanismi molecolari efficienti per affrontare l’accumulo di ROS in eccesso nelle cellule e nei tessuti. Questi meccanismi includono membri della famiglia delle proteine superossido dismutasi (SOD), che catalizzano la dismutazione radicalica del superossido in ossigeno molecolare e perossido di idrogeno, nonché diverse catalasi e perossidasi che utilizzano il pool antiossidante (glutatione, NADPH, perossiredossina, tioredossina ^7,8) per catalizzare la successiva conversione del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno molecolare.

Tuttavia, diversi rapporti supportano il ruolo dei ROS come componenti chiave dei circuiti molecolari che regolano le funzioni cellulari critiche, tra cui proliferazione, differenziazione e mobilità ^2,3,4. Questo concetto è ulteriormente supportato dall’identificazione iniziale e dalla caratterizzazione di meccanismi dedicati che producono ROS in organismi aerobici, tra cui le lipossigenasi cicloossigenasi e le NADPH ossidasi ^9,10. In questo senso, i ROS mostrano un ruolo attivo durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati 11,12,13 e ruoli chiave per queste molecole nella regolazione di specifiche funzioni fisiologiche in vivo sono stati riportati in diversi sistemi sperimentali, tra cui il programma di differenziazione dei progenitori ematopoietici in Drosophila^14, l’induzione di guarigione nel pesce zebra o la rigenerazione della coda nei girini di Xenopus ¹⁵. Nei mammiferi, i ROS sono stati coinvolti nel potenziale di auto-rinnovamento/differenziazione delle cellule staminali neurali in un modello di neurosfera¹⁶ e nella deregolazione della funzione delle cellule staminali intestinali durante l’inizio del cancro del colon-retto¹⁷. Nella pelle, la segnalazione dei ROS è stata associata alla differenziazione epidermica e alla regolazione della nicchia delle cellule staminali cutanee e del ciclo di crescita del follicolo pilifero^18,19.

In questa prospettiva, una delle principali limitazioni sperimentali per determinare i ruoli fisiologici dei ROS nei sistemi biologici, sia in condizioni normali che patologiche, è la mancanza di adeguati strumenti sperimentali per indurre una produzione controllata di queste molecole in cellule e tessuti, assomigliando accuratamente alla loro produzione fisiologica come messaggeri di seconda segnalazione. Allo stato attuale, la maggior parte degli approcci sperimentali prevede la somministrazione di ROS esogeni, principalmente sotto forma di perossido di idrogeno. Abbiamo recentemente implementato un approccio sperimentale per attivare una produzione transitoria e non letale in vivo di ROS endogeni nella pelle del topo, basato sulla somministrazione di precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX (PpIX; ad esempio, acido aminolaevulinico o il suo derivato metilamminolevulinato) e ulteriore irradiazione del campione con luce rossa per indurre la formazione in situ di ROS dall’ossigeno molecolare intracellulare (Figura 1). Questa procedura fotodinamica può essere efficacemente utilizzata per stimolare nicchie di cellule staminali residenti, attivando così i programmi rigenerativi del tessuto^19,20 e aprendo la strada a nuove modalità terapeutiche nella medicina rigenerativa cutanea. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo, mostrando esempi rappresentativi di stimolazione di nicchie di cellule staminali, misurata come un aumento del numero di cellule di mantenimento dell’etichetta (LRC) a lungo termine di 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) nella regione del rigonfiamento del follicolo pilifero^19,21 e successiva attivazione di programmi di rigenerazione (accelerazione della crescita dei capelli e processi di guarigione delle ustioni) indotti da transitori^, produzione non letale di ROS nella cute del ceppo di topo C57Bl6.

Protocol

Tutte le procedure di allevamento e sperimentazione dei topi devono essere condotte in conformità con la legislazione locale, nazionale, internazionale e le linee guida sulla sperimentazione animale. 1. Induzione della crescita dei peli, induzione delle ustioni e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell’epitelio della pelle della coda wholemounts NOTA: Utilizzare topi C57BL/6 di 10 giorni o 7 settimane, preferibilmente cucciolate, per i disegni sperimentali d…

Representative Results

La somministrazione topica del precursore mALA nella pelle della schiena e della coda del topo provoca un accumulo significativo di PpIX nell’intero tessuto e, notevolmente, nel follicolo pilifero, come dimostrato dalla fluorescenza rosa-rossastra di questo composto sotto eccitazione di luce blu (407 nm) (Figura 2A,C). La successiva irradiazione del tessuto trattato con luce rossa (636 nm) ad una fluenza di 2,5−4 J/cm 2 promuove la produzione transitoria di ROS …

Discussion

Qui presentiamo una metodologia che consente un’attivazione transitoria della produzione endogena di ROS in vivo nella pelle di topo con effetti fisiologici. La metodologia si basa su una procedura fotodinamica per indurre una stimolazione controllata e locale del fotosensibilizzatore endogeno PpIX (Figura 1B). Questo approccio sperimentale è uno strumento interessante per studiare la biologia dei ROS in sistemi sperimentali in vivo che costituiscono un progresso significativo rispetto alle…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA