Summary
L’objectif de ce protocole est d’induire une production transitoire in vivo de niveaux non létaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la peau de souris, favorisant ainsi les réponses physiologiques dans les tissus.
Abstract
Ici, nous décrivons un protocole pour induire une photogénération in vivo commutable d’espèces réactives endogènes de l’oxygène (ROS) dans la peau de souris. Cette production transitoire de ROS in situ active efficacement la prolifération cellulaire dans les niches de cellules souches et stimule la régénération tissulaire comme en témoigne fortement l’accélération des processus de cicatrisation des brûlures et de croissance des follicules pileux. Le protocole est basé sur un traitement photodynamique réglable qui traite le tissu avec des précurseurs de la protoporphyrine IX photosensibilisante endogène et irradie davantage le tissu avec de la lumière rouge sous des paramètres physico-chimiques étroitement contrôlés. Dans l’ensemble, ce protocole constitue un outil expérimental intéressant pour analyser la biologie ROS.
Introduction
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont le résultat de la réduction chimique de l’oxygène moléculaire pour former de l’eau et comprennent l’oxygène singulet, l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle 1,2,3. Les ROS ont une durée de vie très courte en raison de leur nature extrêmement réactive chimique. Dans les organismes aérobies, les ROS sont fortuitement formés à l’intérieur des cellules en tant que sous-produit perméable majeur de la respiration aérobie (chaîne de transport d’électrons) dans les mitochondries. L’accumulation transitoire de niveaux élevés de ROS dans la cellule entraîne une condition de stress oxydatif qui peut provoquer l’inactivation irréversible des protéines, des lipides et des sucres et l’introduction de mutations dans la molécule d’ADN 2,3,4,5. L’accumulation progressive de dommages oxydatifs dans les cellules, les tissus et les organismes entiers augmente régulièrement avec le temps et a été associée à l’induction de programmes de mort cellulaire, à plusieurs pathologies et au processus de vieillissement 2,3,4,6.
Les organismes aérobies ont régulièrement développé des mécanismes moléculaires efficaces pour lutter contre l’accumulation excessive de ROS dans les cellules et les tissus. Ces mécanismes comprennent des membres de la famille des protéines superoxyde dismutase (SOD), qui catalysent la dismutation radicalaire superoxyde en oxygène moléculaire et en peroxyde d’hydrogène, ainsi que différentes catalases et peroxydases qui utilisent le pool antioxydant (glutathion, NADPH, peroxyrédoxine, thiorédoxine 7,8) pour catalyser la conversion ultérieure du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène moléculaire.
Cependant, plusieurs rapports soutiennent le rôle des ROS en tant que composants clés des circuits moléculaires qui régulent les fonctions cellulaires critiques, y compris la prolifération, la différenciation et la mobilité 2,3,4. Ce concept est également soutenu par l’identification initiale et la caractérisation de mécanismes dédiés à la production de ROS dans les organismes aérobies, y compris les lipoxygénases cyclooxygénases et les NADPH oxydases 9,10. En ce sens, les ROS jouent un rôle actif dans le développement des embryons de vertébrés 11,12,13 et des rôles clés pour ces molécules dans la régulation de fonctions physiologiques in vivo spécifiques ont été rapportés dans différents systèmes expérimentaux, y compris le programme de différenciation des progéniteurs hématopoïétiques chez Drosophila14, l’induction de guérison chez le poisson zèbre ou la régénération de la queue chez les têtards Xenopus 15. Chez les mammifères, les ROS ont été impliqués dans le potentiel d’auto-renouvellement / différenciation des cellules souches neurales dans un modèle de neurosphère16 et dans la dérégulation de la fonction des cellules souches intestinales lors de l’initiation du cancer colorectal17. Dans la peau, la signalisation ROS a été associée à la différenciation épidermique et à la régulation de la niche des cellules souches cutanées et du cycle de croissance du follicule pileux18,19.
Dans cette perspective, une limitation expérimentale majeure pour déterminer les rôles physiologiques des ROS dans les systèmes biologiques, à la fois dans des conditions normales ou pathologiques, est le manque d’outils expérimentaux adéquats pour induire une production contrôlée de ces molécules dans les cellules et les tissus, ressemblant précisément à leur production physiologique en tant que seconds messagers de signalisation. À l’heure actuelle, la plupart des approches expérimentales impliquent l’administration de ROS exogènes, principalement sous forme de peroxyde d’hydrogène. Nous avons récemment mis en œuvre une approche expérimentale pour activer une production in vivo transitoire et non létale de ROS endogènes dans la peau de souris, basée sur l’administration de précurseurs de la protoporphyrine IX photosensibilisante endogène (PpIX; par exemple, l’acide aminolaevulinique ou son dérivé méthylique méthylaminolévulinate) et une irradiation supplémentaire de l’échantillon avec de la lumière rouge pour induire la formation in situ de ROS à partir d’oxygène moléculaire intracellulaire (Figure 1). Cette procédure photodynamique peut être utilisée efficacement pour stimuler les niches de cellules souches résidentes, activant ainsi les programmes de régénération du tissu19,20 et ouvrant la voie à de nouvelles modalités thérapeutiques en médecine régénérative de la peau. Ici, nous présentons une description détaillée du protocole, montrant des exemples représentatifs de stimulation des niches de cellules souches, mesurée comme une augmentation du nombre de cellules retenant marquées à long terme de la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) dans la région du renflement du follicule pileux19,21, et l’activation ultérieure des programmes de régénération (accélération de la croissance des cheveux et processus de guérison des brûlures) induite par transitoire, production non létale de ROS dans la peau de la souche de souris C57Bl6.
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Protocol
Toutes les procédures d’élevage et d’expérimentation de souris doivent être menées conformément à la législation locale, nationale et internationale et aux directives sur l’expérimentation animale.
1. Induction de la croissance des cheveux, induction de brûlures et identification des LRC BrdU à long terme dans l’épithélium de la peau de la queue
REMARQUE : Utilisez des souris C57BL/6 âgées de 10 ou 7 semaines, de préférence des compagnons de portée, pour les plans expérimentaux décrits ci-dessous. Dans toutes les procédures expérimentales, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane à 3% ou euthanasiés par luxation cervicale comme indiqué.
- Induction de la croissance des poils dans la peau arrière des souris dans la deuxième phase télogène (repos) (environ 50e jour post-natal)
- Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane à 3%. Confirmer une anesthésie profonde complète par l’absence d’un réflexe de pédale (pincement ferme des orteils). Rasez deux régions indépendantes côte à côte de la peau du dos chez chaque souris à l’aide de tondeuses à cheveux et de crème dépilatoire (Tableau des matériaux). Utilisez le côté gauche pour le contrôle et le côté droit pour le traitement.
NOTE: Vérifiez que, après le rasage, la peau sous-jacente du dos est rosâtre et non grise/noire, un indicateur de mélanogénèse et d’entrée dans la phase anagène (croissance) chez cette souche de souris. - Laver soigneusement avec du PBS pour éliminer tous les restes de crème et procéder à l’induction de la production transitoire in situ de niveaux de ROS non létaux comme décrit à la rubrique 2.1.
- Enregistrez la croissance des follicules pileux grâce à l’acquisition quotidienne d’images haute résolution des zones de la peau du dos contrôlées et traitées chez chaque animal (p. ex., à l’aide d’une caméra HD couplée à une lentille binoculaire 5−20x).
- Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane à 3%. Confirmer une anesthésie profonde complète par l’absence d’un réflexe de pédale (pincement ferme des orteils). Rasez deux régions indépendantes côte à côte de la peau du dos chez chaque souris à l’aide de tondeuses à cheveux et de crème dépilatoire (Tableau des matériaux). Utilisez le côté gauche pour le contrôle et le côté droit pour le traitement.
- Induction de lésions de brûlure au 2edegré dans la peau arrière de souris dans la deuxième phase télogène (repos) (environ 50e jour post-natal)
- Anesthésier les souris. Rasez toute la région de la peau du dos chez chaque souris à l’aide de tondeuses à cheveux et de crème dépilatoire et lavez soigneusement avec du PBS pour éliminer tous les restes de crème.
NOTE: Administrer in situ des injections sous-cutanées de lidocaïne à 0,5% (2 mg / ml) dans une solution saline stérile, ne dépassant pas 7 mg / ml, juste avant la procédure de combustion. - Préchauffer une barre de laiton (1 cm de section) à 95 °C en l’immergeant dans de l’eau bouillante, puis appliquer sur la région centrale de la surface dorsale de la peau dorsale de chaque souris pendant 5 s.
- Juste après la génération de la brûlure, injecter par voie intrapéritonéale aux animaux 1 mL de solution physiologique (0,9% NaCl) sur une couverture électrique pour prévenir la déshydratation. Laisser les animaux récupérer pendant 24 h et procéder à l’induction d’une production transitoire in situ de niveaux de ROS non létaux comme décrit à la section 2.3.
- Enregistrer la progression de la brûlure grâce à l’acquisition quotidienne d’images haute résolution des zones de la peau du dos témoins et traitées chez chaque animal (p. ex., à l’aide d’une caméra HD couplée à une lentille binoculaire 5−20x).
- Anesthésier les souris. Rasez toute la région de la peau du dos chez chaque souris à l’aide de tondeuses à cheveux et de crème dépilatoire et lavez soigneusement avec du PBS pour éliminer tous les restes de crème.
- Génération et identification de CRL BrdU à long terme dans l’épithélium cutané de la queue
- Injecter des compagnons de portée âgés de 10/14 jours par voie intrapéritonéale (sans anesthésie) une fois par jour pendant 4 jours consécutifs avec 50 mg/kg de poids corporel de BrdU dissous dans du PBS. Après la phase d’étiquetage, laisser les souris se développer pendant 50 à 60 jours avant tout traitement.
REMARQUE: Utilisez une aiguille fraîche pour chaque injection. - Procéder comme décrit à la rubrique 2.3 pour l’induction d’une production transitoire in situ non létale de ROS dans la peau de la queue à différents moments avant la préparation des tissus entiers.
- Pour préparer des montures entières d’épiderme de la queue, euthanasier les souris par luxation cervicale et couper les queues avec des ciseaux chirurgicaux.
- Utilisez un scalpel pour faire une incision longitudinale droite tout le long de la queue et pelez toute la peau en une seule pièce de la colonne vertébrale. Incuber la peau pelée dans 5 mM d’EDTA dans du PBS dans des tubes de 5 mL pendant 4 h à 37 °C et séparer soigneusement les feuilles intactes de l’épiderme du derme à l’aide de forceps.
- Fixer le tissu dans du formaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant au moins 72 h à température ambiante (RT) et procéder à la détection BrdU à l’aide d’anticorps appropriés.
- Utiliser la microscopie à fluorescence/confocale pour identifier et quantifier les CRL dans chaque condition expérimentale, y compris les contrôles de la lumière et les traitements photodynamiques à différents moments avant la préparation des tissus entiers, comme décrit précédemment en détail19,20.
REMARQUE : Les feuilles épidermiques fixes peuvent être conservées dans du PBS contenant 0,02 % d’azoture de sodium à 4 °C pendant une période maximale de trois mois. Des feuillets épidermiques fixes peuvent être utilisés pour l’immunolocalisation des protéines requises en suivant les procédures standard des coupes histologiques.
- Injecter des compagnons de portée âgés de 10/14 jours par voie intrapéritonéale (sans anesthésie) une fois par jour pendant 4 jours consécutifs avec 50 mg/kg de poids corporel de BrdU dissous dans du PBS. Après la phase d’étiquetage, laisser les souris se développer pendant 50 à 60 jours avant tout traitement.
2. Induction de la production transitoire de niveaux de ROS non létaux dans la peau de souris
NOTE: Pour induire une production transitoire de niveaux de ROS non létaux dans la peau de souris, un traitement photodynamique utilisant un précurseur du photosensibilisateur endogène PpIX, dans ce cas, le méthyl-aminolévulinate (mALA), et la lumière rouge sera utilisé.
- Pour activer la production transitoire de ROS en vue de l’induction de la croissance des poils dans la peau du dos, préparer les animaux comme indiqué à la section 1.1.
- Appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique (Tableau des matériaux) sur la région droite, en gardant le côté gauche comme contrôle interne en évitant les différences interindividuelles. Incuber pendant 2,5 h dans l’obscurité, laver soigneusement l’excès de crème avec du PBS. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
NOTE: La production de PpIX dans la peau du dos doit être testée in situ par sa fluorescence rouge sous excitation de lumière bleue (407 nm). - Anesthésiez les animaux.
- Irradier toute la peau du dos avec une source de lumière rouge adéquate (tableau des matériaux) pour une dose totale de 2,5−4 J/cm2. Gardez les souris sur une couverture chauffante jusqu’à leur rétablissement complet et procédez comme décrit à l’étape 1.1.3.
REMARQUE : L’éclairement énergétique doit être ajusté en manipulant la distance entre la source lumineuse et le tissu et mesuré à l’aide d’un compteur d’énergie de puissance (Tableau des matériaux). L’expérience est considérée comme terminée lorsque la croissance complète des poils est observée dans l’une des régions rasées indépendantes de chaque animal. L’ensemble de la procédure implique un seul traitement photo.
- Appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique (Tableau des matériaux) sur la région droite, en gardant le côté gauche comme contrôle interne en évitant les différences interindividuelles. Incuber pendant 2,5 h dans l’obscurité, laver soigneusement l’excès de crème avec du PBS. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
- Pour activer la production transitoire de ROS pour améliorer la cicatrisation des lésions de brûlure au 2edegré , préparer les animaux comme indiqué à la rubrique 1.2.
- Appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique tout le long de la surface brûlée, englobant environ 4 mm de tissu adjacent. Incuber pendant 2,5 h dans l’obscurité, laver soigneusement l’excès de crème avec du PBS. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
- Anesthésiez les animaux.
- Irradier toute la peau du dos avec une source de lumière rouge adéquate pour une dose totale de 2,5−4 J/cm2. Gardez les souris sur une couverture chauffante jusqu’à leur rétablissement complet et procédez comme décrit à l’étape 1.2.4.
NOTE: La procédure expérimentale pour chaque animal est considérée comme terminée lorsque la guérison complète des brûlures est observée. L’ensemble de la procédure implique un seul traitement photo.
- Pour activer la production transitoire de ROS dans la peau de la queue, préparer les souris comme indiqué à la rubrique 1.3, appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique tout au long de la zone du tissu dorsal et procéder comme décrit à la rubrique 2.1 pour la peau du dos. Effectuer des traitements photographiques et des contrôles de la lumière correspondante 24 h, 48 h ou 72 h avant l’euthanasie des animaux et l’extraction ultérieure des montures entières de peau de queue.
REMARQUE : Dans tous les modèles expérimentaux, doser la dépendance aux ROS du procédé à l’aide de piégeurs de ROS antioxydants (p. ex., inoculation quotidienne de 100 mg/kg de poids corporel de N-acétyl-cystéine par injection intrapéritonéale d’une solution à 20 mg/mL dans du PBS, pH 7,2, en commençant 5 jours avant les traitements mALA ou, alternativement, deux doses de 100 mg/mL d’acide ascorbique dans de l’éthanol à 50 %, espacé de 30 min, appliqué localement sur la peau dans l’intervalle de temps entre les traitements mALA et l’irradiation à la lumière rouge).
3. Détection des ROS dans la peau
- Évaluation ex vivo de la production de ROS dans la peau de la queue après traitement photodynamique à l’hydroéthidine
REMARQUE: L’hydroéthidine est une molécule non fluorescente qui réagit spécifiquement avec les ROS pour produire un colorant fluorescent 2-hydroxyéthidium (hET).- Incuber des peaux entières de queue, obtenues comme décrit à la section 1.3.3, pendant 3 h à 37 °C dans 5 mM d’EDTA dans une solution de PBS (échantillons témoins) ou contenant en outre 2 mM de mALA (échantillons de traitement photodynamique).
- Dans tous les cas, ajouter de l’hydroéthidine à une concentration finale de 3,2 μM à partir d’un stock de 25 mg/mL dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à TA.
- Étirer les échantillons de peau de la queue sur une surface en verre du bout des doigts et irradier avec une lumière rouge de 636 nm à une fluence de 10 J/cm2 .
- Procéder immédiatement à la séparation de l’épiderme du derme et fixer les feuillets épidermiques comme décrit à la rubrique 1.3.3.
- Évaluez l’émission de rouge hET sous un microscope à fluorescence/confocale à l’aide d’une lumière verte excitante, capturez des images de haute qualité et procédez à une analyse plus approfondie.
REMARQUE : Utiliser la coloration hET des échantillons de tissus en l’absence de traitement photodynamique comme témoin négatif de l’oxydation hET.
- Détection in vivo de la production de ROS dans la peau arrière après induction de la croissance des cheveux et cicatrisation des brûlures suivie d’un traitement photodynamique
REMARQUE: Cette étape est réalisée à l’aide de diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (DHF-DA), un composé non fluorescent perméable de cellules qui, après clivage par des enzymes estérases intracellulaires, réagit spécifiquement avec ROS en donnant le colorant fluorescent 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF).- Utiliser des animaux préparés pour l’induction de la croissance des poils (section 1.1) ou la cicatrisation des brûlures (section 1.2). Juste avant les traitements topiques à la crème mALA (voir rubriques 2.1 et 2.2), distribuer par voie topique 100 μL de 1 mg/mL dans de l’éthanol à 50 % de DHF-DA sur toutes les zones cutanées cibles/traitées, laisser la peau absorber complètement le matériau et procéder à l’application topique de crème mALA.
- Incuber les animaux traités pendant 4 h dans l’obscurité, laver soigneusement la crème topique mALA de la peau avec du PBS et distribuer une deuxième dose de 100 μL de solution de DHF-DA sur la peau. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
- Incuber les animaux traités pendant 50 min dans l’obscurité, anesthésier et irradier toute la peau du dos avec une fluence allant de 2,5 à 4 J/cm2 de lumière rouge 636 nm à l’aide d’une lampe LED.
- Immédiatement après l’irradiation, évaluer les niveaux de ROS générés dans la peau à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (Tableau des matériaux). Réglez le boîtier de filtre pour une excitation de 445 à 490 nm et une émission de 515 à 575 nm, capturez des images de haute qualité et procédez à une analyse plus approfondie.
REMARQUE : Utiliser la coloration DHF-DA des échantillons de tissus en l’absence de traitement photodynamique comme témoin négatif pour l’auto-oxydation DHF-DA.
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Representative Results
L’administration topique du précurseur mALA dans le dos et la peau de la queue de souris entraîne une accumulation significative de PpIX dans l’ensemble du tissu et, en particulier, dans le follicule pileux, comme le démontre la fluorescence rose rougeâtre de ce composé sous excitation en lumière bleue (407 nm) (Figure 2A,C). L’irradiation ultérieure du tissu traité avec une lumière rouge (636 nm) à une fluence de 2,5−4 J/cm2 favorise la production transitoire de ROS dans le tissu, en particulier dans la région du renflement du follicule pileux (Figure 2B,D).
L’activation in vivo de la production non létale de ROS dans la peau de souris favorise une augmentation significative du nombre de CRL, classés comme cellules souches somatiques, dans la région du renflement du follicule pileux deux jours après les phototraitements (Figure 3, panneaux de gauche). Notamment, l’augmentation du nombre de CRL est transitoire, revenant à des niveaux normaux 6 jours après les traitements (Figure 3, panneau de droite). Comme cette région est l’une des principales niches de cellules souches dans la peau de souris, une induction transitoire de la prolifération cellulaire dans cette région reflète principalement l’activation fonctionnelle de la niche du renflement et des programmes de prolifération et de différenciation des cellules souches résidentes22,23.
L’activation dépendante des ROS de la niche du follicule pileux est en outre associée à des réponses physiologiques dans la peau. Ainsi, la production transitoire de ROS accélère considérablement le processus de cicatrisation de la peau après une brûlure de 2e degré (Figure 4A,B). La quantification de la réduction progressive de la zone cutanée endommagée/de la gale démontre la robustesse et la signification statistique du processus d’accélération de la cicatrisation induit par la production transitoire de ROS dépendante de PpIX dans le tissu (Figure 4C). De la même manière, les niveaux de ROS non létaux favorisent fortement la croissance des cheveux après le rasage au cours du deuxième télogène coordonné (Figure 5A), une phase au cours de laquelle le follicule pileux est réfractaire pour répondre aux stimuli de croissance22,23, constituant un moyen adéquat d’évaluer le potentiel de nouveaux composés et/ou processus pour stimuler la croissance des cheveux. Notamment, l’utilisation de composés antioxydants comme l’acide ascorbique (AA) entraîne une réduction statistiquement significative du nombre d’animaux présentant une croissance accélérée des poils (Figure 5B). De plus, la production de ROS dans la peau après les phototraitements, quantifiée par l’émission fluorescente de DHF dans la peau, est également significativement réduite par les composés antioxydants (Figure 5C). Ensemble, ces résultats démontrent que la production de ROS après des phototraitements à base de PpIX est strictement nécessaire pour induire une réponse physiologique dans le tissu.
Figure 1 : Contexte théorique de la mise en marche contrôlée de la production photodynamique endogène de ROS in situ dans les cellules et les tissus à l’aide de la voie de biosynthèse de l’hème. (A) Représentation schématique des réactions photochimiques de base entraînant une excitation moléculaire de l’oxygène au cours des traitements photodynamiques. Lors de l’absorption de la lumière avec le λ approprié, une molécule photosensibilisante (PS) dans l’état fondamental S0 subit une transition vers un état singulet excité S1. Puisque tout état excité est énergétiquement moins préférable que l’état fondamental, la molécule revient à S0 après une courte période de temps. La plupart des PS ont une efficacité quantique élevée pour la transition de S 1 à l’état triplet T1, généralement caractérisée par une durée de vie relativement longue. Le PS activé à l’état triplet excité peut réagir avec d’autres molécules via deux voies différentes. Une réaction photochimique de type I est le transfert d’électrons vers des molécules adjacentes pour former des espèces radicalaires; ces radicaux sont susceptibles de réagir avec l’oxygène moléculaire pour produire des ROS, notamment l’anion superoxyde (•O2-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (•OH). Une réaction photochimique de type II représente le procédé dominant pour la plupart des PS employés dans la PDT. Au cours de cette réaction, le transfert d’énergie (et non d’électrons) à l’oxygène moléculaire (dont la configuration à l’état fondamental est le triplet, 3O2) entraîne la formation de l’oxygène singulet non radicalaire mais hautement réactif (1O2). Les photoproduits formés au cours de ces réactions déclenchent une cascade d’événements biochimiques entraînant un stress oxydatif qui provoque finalement la mort cellulaire ou qui peut potentiellement stimuler la croissance cellulaire. (B) L’acide 5-aminolévulinique (ALA) est un précurseur naturel de la voie de biosynthèse de l’hème, qui implique à la fois les compartiments cellulaires mitochondriaux et cytosoliques. L’activité enzymatique de l’ALA synthase est régulée par un contrôle par rétroaction négative par lequel l’hème libre, le produit final de cette voie, inhibe la synthèse de l’ALA à partir de la glycine et du succinyl CoA. L’administration d’ALA exogène ou de son dérivé méthyl aminolévulinate (mALA) contourne le système de rétroaction réglementaire, de sorte que les métabolites en aval, en particulier la protoporphyrine IX (PpIX), s’accumulent dans la cellule induisant la photosensibilisation. Les caractéristiques limitantes de la ferrochelatase, enzyme catalyseur de l’insertion du fer dans PpIX, favorisent l’accumulation de ce composé PS endogène. PBG = porphobilinogène. Cette figure a été modifiée à partir de Carrasco et al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le traitement photodynamique au mALA et à la lumière rouge induit une production transitoire de ROS dans la peau. (A) Accumulation de PpIX endogène après traitement topique mALA dans la peau du dos. Le côté gauche chez le même animal a été utilisé comme témoin. (B) Panneau de gauche: production ROS dépendante de PpIX (mALA+Light) surveillée par DHF-DA. Panneau de droite : analyse du parcours temporel de la production relative de ROS dans la peau du dos; la densité relative intégrée de l’émission fluorescente DHF-DA des régions mALA+Lumière par rapport à la Lumière chez chaque animal a été quantifiée à différents moments après irradiation et normalisée comme décrit dans la méthodologie. La moyenne ± SE était représentée (n = 4 pour chaque point temporel). (C) Localisation de PpIX dans la peau de la queue (images de microscopie à fluorescence). (D) Production de ROS dans la peau de la queue après mALA+Light révélée par hET montrant une accumulation accrue et soutenue dans la région du renflement du follicule pileux. Des images représentatives de microscopie confocale (projections maximales) sont présentées. Barre d’échelle = 100 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Carrasco et al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’activation in situ de la production de ROS dans la peau favorise une augmentation significative des cellules souches dans la région du renflement de la niche du follicule pileux. Panneaux de gauche: images de microscopie confocale représentatives (projections maximales) montrant la localisation des cellules de rétention du marqueur BrdU (LRC) dans les montures entières de peau de queue de souris et l’augmentation évidente de LRC dans la région du renflement des follicules pileux 2 jours après les phototraitements à base de PpIX. Panneau de droite: quantification du nombre de LRC dans la région du renflement du follicule pileux. La moyenne + SE (n = 4) est représentée. Barre d’échelle = 50 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Carrasco et al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’activation de la production in situ de ROS dans la peau accélère la cicatrisation des brûlures. (A) Production de PpIX induite par mALA dans les régions brûlées chez les animaux traités par rapport aux échantillons témoins. (B) Évolution de la guérison des brûlures chez les animaux traités et témoins mALA+Lumière. (C) Quantification temporelle des zones brûlées (panneau de gauche) montrant une cicatrisation accélérée des brûlures chez les animaux traités mALA+ Lumière; la moyenne + SE (n = 4) de la zone non cicatrisée est représentée. Analyse de l’aire sous la courbe (panneau de droite) montrant les différences statistiques entre les deux courbes temps-parcours (p ≤ 0,06). Cette figure a été modifiée à partir de Carrasco et al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L’activation in situ de la production de ROS dans la peau stimule la croissance des cheveux. (A) Rangée du haut : Induction de la croissance des cheveux pendant la phase télogène réfractaire par mALA+Light (côté droit de la peau dorsale) par rapport à la région témoin légère (côté gauche). Rangée du bas: La production de ROS dans la peau et l’accélération de la croissance des cheveux induite par mALA+Light sont inhibées par le traitement antioxydant à l’acide ascorbique (AA). (B) Quantification du pourcentage d’animaux présentant une croissance accélérée des poils dans le mALA-PT par rapport à la région témoin en l’absence ou en présence de l’antioxydant AA (n = 4 dans 3 expériences indépendantes). (C) Quantification de l’inhibition de la production de ROS dans la peau dorsale induite par AA au cours de mALA-PT (n = 4). Dans tous les cas, les barres représentent la moyenne + SE. Cette figure a été modifiée à partir de Carrasco et al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous présentons une méthodologie qui permet une activation transitoire de la production endogène de ROS in vivo dans la peau de souris avec des effets physiologiques. La méthodologie est basée sur une procédure photodynamique pour induire une stimulation contrôlée et locale du photosensibilisateur endogène PpIX (Figure 1B). Cette approche expérimentale est un outil intéressant pour étudier la biologie des ROS dans des systèmes expérimentaux in vivo constituant une avancée significative par rapport aux méthodologies utilisant des sources externes de ROS (généralement du peroxyde d’hydrogène) et permettant une production contrôlée et locale de ROS dans le tissu/échantillon.
Étant donné que les précurseurs à base d’aminolévulinate sont administrés en excès pour favoriser l’accumulation de PpIX à l’intérieur des cellules, une étape critique de cette méthodologie est l’établissement d’une dose lumineuse adéquate pour induire une production transitoire de niveaux de ROS dans le tissu en dessous du seuil de dommage mais montrant un fort effet stimulant. Actuellement, il n’existe aucune technologie permettant de quantifier directement la quantité exacte de tout type de ROS produite dans les cellules et les tissus. Dans notre méthodologie, il n’est toujours pas possible d’établir une corrélation directe entre une dose lumineuse donnée, la quantité exacte de ROS produite et un effet biologique donné (par exemple, la mort cellulaire ou la prolifération cellulaire). Pour cette raison, la dose lumineuse (fluence) pour tout modèle expérimental particulier devrait être établie empiriquement par le chercheur à l’aide de paramètres qualitatifs ou semi-qualitatifs de choix pour chaque situation. Dans le cas de la peau de souris, nous choisissons une transition facilement mesurable entre la mort cellulaire et les lésions tissulaires et l’induction d’une onde proliférative significative et transitoire.
La méthodologie présentée ici s’est avérée très efficace dans l’amélioration de la régénération de la peau dans différents processus, y compris la cicatrisation des brûlures et la croissance des follicules pileux. Ces observations ouvrent la voie à la mise en œuvre d’applications thérapeutiques de cette technologie dans les cliniques pour le traitement de brûlures et plaies fortuites ou chroniques ou pour différentes pathologies cutanées et, en particulier, du follicule pileux impliquant un fonctionnement défectueux des cellules souches.
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Disclosures
Toutes les applications commerciales des procédures décrites dans ce travail sont protégées par un brevet CSIC-UAM (EP2932967A1) rédigé par EC, MIC et JE et concédé sous licence à Derma Innovate SL pour une exploitation commerciale. JE et JJM occupent un poste consultatif au sein de Derma Innovate SL.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 à JE) et de l’Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 to JE) d’Espagne. EC a été soutenu par la subvention Atracción de Talento Investigador 2017-T2 / BMD-5766 (Comunidad de Madrid et UAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
