"सीटू में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्विचेबल प्रोटोपोर्फिरिन IX-निर्भर फोटोजनरेशन द्वारा माउस त्वचा में स्टेम सेल निच और ऊतक पुनर्जनन की उत्तेजना"
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माउस त्वचा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के गैर-घातक स्तरों के विवो उत्पादन में क्षणिक को प्रेरित करना है, जिससे ऊतक में शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा मिलता है।
Abstract
यहां, हम माउस त्वचा में अंतर्जात प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के विवो फोटोजनरेशन में स्विच करने योग्य को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सीटू में आरओएस का यह क्षणिक उत्पादन स्टेम सेल आला में सेल प्रसार को कुशलतापूर्वक सक्रिय करता है और ऊतक पुनर्जनन को उत्तेजित करता है जैसा कि जलने की चिकित्सा और बाल कूप विकास प्रक्रियाओं के त्वरण के माध्यम से दृढ़ता से प्रकट होता है। प्रोटोकॉल एक विनियमित फोटोडायनामिक उपचार पर आधारित है जो ऊतक को अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटोपोर्फिरीन IX के अग्रदूतों के साथ इलाज करता है और आगे कसकर नियंत्रित भौतिक रासायनिक मापदंडों के तहत लाल प्रकाश के साथ ऊतक को विकिरणित करता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल आरओएस जीव विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक दिलचस्प प्रयोगात्मक उपकरण का गठन करता है।
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) पानी बनाने के लिए आणविक ऑक्सीजन की रासायनिक कमी का परिणाम हैं, और इसमें सिंगलेट ऑक्सीजन, सुपरऑक्साइड आयन, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और हाइड्रॉक्सिल रेडिकल 1,2,3 शामिल हैं। आरओएस का जीवनकाल उनकी अत्यंत रासायनिक प्रतिक्रियाशील प्रकृति के कारण बहुत कम है। एरोबिक जीवों में, आरओएस संयोग से माइटोकॉन्ड्रिया में एरोबिक श्वसन (इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला) के एक प्रमुख रिसाव उप-उत्पाद के रूप में कोशिकाओं के अंदर बनता है। कोशिका में आरओएस के उच्च स्तर के क्षणिक संचय के परिणामस्वरूप एक ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति होती है जो प्रोटीन, लिपिड और शर्करा की अपरिवर्तनीय निष्क्रियता और डीएनए अणु 2,3,4,5 में उत्परिवर्तन की शुरूआत को उत्तेजित कर सकती है। कोशिकाओं, ऊतकों और पूरे जीवों में ऑक्सीडेटिव क्षति का क्रमिक संचय समय के साथ लगातार बढ़ता है और कोशिका मृत्यु कार्यक्रमों, कई विकृतियों और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया 2,3,4,6 के प्रेरण से जुड़ा हुआ है।
एरोबिक जीवों ने कोशिकाओं और ऊतकों में अतिरिक्त आरओएस संचय से निपटने के लिए कुशल आणविक तंत्र विकसित किए हैं। इन तंत्रों में सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) प्रोटीन परिवार के सदस्य शामिल हैं, जो आणविक ऑक्सीजन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड में सुपरऑक्साइड रेडिकल डिसम्यूटेशन को उत्प्रेरित करते हैं, साथ ही विभिन्न कैटालसेस और पेरोक्सीडेज जो एंटीऑक्सिडेंट पूल (ग्लूटाथियोन, एनएडीपीएच, पेरोक्सीरेडॉक्सिन, थियोरेडॉक्सिन 7,8) का उपयोग करते हैं ताकि हाइड्रोजन पेरोक्साइड के बाद के रूपांतरण को पानी और आणविक ऑक्सीजन में उत्प्रेरित किया जा सके।
हालांकि, कई रिपोर्टें आणविक सर्किट के प्रमुख घटकों के रूप में आरओएस की भूमिका का समर्थन करती हैं जो प्रसार, भेदभाव और गतिशीलता 2,3,4 सहित महत्वपूर्ण सेल कार्यों को नियंत्रित करती हैं। इस अवधारणा को एरोबिक जीवों में समर्पित आरओएस-उत्पादक तंत्र की प्रारंभिक पहचान और लक्षण वर्णन द्वारा समर्थित किया गया है, जिसमें लिपोक्सीजेनेस साइक्लोऑक्सीजिनेज और एनएडीपीएच ऑक्सीडेज 9,10 शामिल हैं। इस अर्थ में, आरओएस कशेरुक भ्रूण के विकास के दौरान एक सक्रिय भूमिका प्रदर्शित करता है 11,12,13 और विवो शारीरिक कार्यों में विशिष्टके नियमन में इन अणुओं के लिए महत्वपूर्ण भूमिकाओं को विभिन्न प्रयोगात्मक प्रणालियों में रिपोर्ट किया गया है, जिसमें ड्रोसोफिला14 में हेमटोपोइएटिक पूर्वजों का भेदभाव कार्यक्रम, जेब्राफिश में उपचार प्रेरण, या जेनोपस टैडपोल 15 में पूंछ पुनर्जनन शामिल है।. स्तनधारियों में, आरओएस एक न्यूरोस्फीयर मॉडल16 में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के आत्म-नवीकरण / भेदभाव क्षमता में और कोलोरेक्टल कैंसर दीक्षा17 के दौरान आंतों के स्टेम सेल फ़ंक्शन के विनियमन में शामिल रहा है। त्वचा में, आरओएस सिग्नलिंग एपिडर्मल भेदभाव और त्वचा स्टेम सेल आला और बाल कूप विकास चक्र18,19 के विनियमन से जुड़ा हुआ है।
इस परिप्रेक्ष्य में, जैविक प्रणालियों में आरओएस की शारीरिक भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए एक प्रमुख प्रयोगात्मक सीमा, दोनों सामान्य या पैथोलॉजिकल स्थितियों में, कोशिकाओं और ऊतकों में इन अणुओं के नियंत्रित उत्पादन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी है, जो दूसरे सिग्नलिंग संदेशवाहक के रूप में उनके शारीरिक उत्पादन से सटीक रूप से मिलते-जुलते हैं। वर्तमान में, अधिकांश प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों में बहिर्जात आरओएस का प्रशासन शामिल है, ज्यादातर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के रूप में। हमने हाल ही में माउस त्वचा में अंतर्जात आरओएस के विवो उत्पादन में एक क्षणिक, गैर-घातक पर स्विच करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण लागू किया है, जो अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटोपोर्फिरीन IX (पीपीआईएक्स; जैसे, एमिनोलेवुलिनिक एसिड या इसके मिथाइल व्युत्पन्न मिथाइलएमिनोलेवुलिनेट) के अग्रदूतों के प्रशासन पर आधारित है और इंट्रासेल्युलर आणविक ऑक्सीजन से आरओएस के सीटू गठन को प्रेरित करने के लिए लाल प्रकाश के साथ नमूने का आगे विकिरण (चित्रा 1)।). इस फोटोडायनामिक प्रक्रिया का उपयोग कुशलतापूर्वक निवासी स्टेम सेल आला को उत्तेजित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार ऊतक19,20 के पुनर्योजी कार्यक्रमों को सक्रिय करता है और त्वचा पुनर्योजी चिकित्सा में नए चिकित्सीय तौर-तरीकों के लिए रास्ता खोलता है। यहां, हम प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं, जो स्टेम सेल आला की उत्तेजना के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं, जिसे बाल कूप19,21 के उभार क्षेत्र में दीर्घकालिक 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू) लेबल रिटेनिंग कोशिकाओं (एलआरसी) की संख्या में वृद्धि के रूप में मापा जाता है, और बाद में पुनर्जनन कार्यक्रमों (बालों के विकास और जलने की चिकित्सा प्रक्रियाओं का त्वरण) के सक्रियण के रूप में मापा जाता है। C57Bl6 माउस तनाव की त्वचा में गैर-घातक ROS उत्पादन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं जो शारीरिक प्रभावों के साथ माउस त्वचा में विवो में अंतर्जात आरओएस उत्पादन के क्षणिक सक्रियण की अनुमति देता है। कार्यप्रणाली अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र पीपीआईएक्स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्पेन के मिनिस्टरियो डी इकोनोमिया वाई कॉम्पेटिविडाड (आरटीसी-2014-2626-1 से जेई) और इंस्टीट्यूटो डी सालुद कार्लोस III (पीआई 15/01458 से जेई) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है। ईसी को एट्राकिओन डी टैलेंटो इन्वेस्टिगडोर अनुदान 2017-टी 2 / बीएमडी -5766 (कोमुनिडैड डी मैड्रिड और यूएएम) द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
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