Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die vorübergehende In-vivo-Produktion von nicht-letalen Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen zu induzieren und so die physiologischen Reaktionen im Gewebe weiter zu fördern.

Abstract

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur induzierbaren in vivo Photogenerierung von endogenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen. Diese transiente Produktion von ROS in situ aktiviert effizient die Zellproliferation in Stammzellnischen und stimuliert die Geweberegeneration, was sich stark in der Beschleunigung von Verbrennungsheilungs- und Haarfollikelwachstumsprozessen manifestiert. Das Protokoll basiert auf einer regulierbaren photodynamischen Behandlung, bei der das Gewebe mit Vorstufen des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX behandelt und das Gewebe unter streng kontrollierten physikalisch-chemischen Parametern weiter mit rotem Licht bestrahlt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll ein interessantes experimentelles Werkzeug zur Analyse der ROS-Biologie dar.

Introduction

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind das Ergebnis der chemischen Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser und umfassen Singulett-Sauerstoff, Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid und das Hydroxylradikal ^1,2,3. ROS haben aufgrund ihrer extrem chemisch reaktiven Natur eine sehr kurze Lebensdauer. In aeroben Organismen werden ROS zufällig in den Zellen als großes undichtes Nebenprodukt der aeroben Atmung (Elektronentransportkette) in den Mitochondrien gebildet. Die vorübergehende Anhäufung hoher ROS-Konzentrationen in der Zelle führt zu einem oxidativen Stresszustand, der die irreversible Inaktivierung von Proteinen, Lipiden und Zuckern und die Einführung von Mutationen im DNA-Molekül 2,3,4,5 provozieren kann. Die allmähliche Anhäufung oxidativer Schäden in Zellen, Geweben und ganzen Organismen nimmt mit der Zeit stetig zu und wurde mit der Induktion von Zelltodprogrammen, verschiedenen Pathologien und dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht 2,3,4,6.

Aerobe Organismen haben stetig effiziente molekulare Mechanismen entwickelt, um die übermäßige ROS-Akkumulation in Zellen und Geweben zu bekämpfen. Zu diesen Mechanismen gehören Mitglieder der Superoxiddismutase (SOD)-Proteinfamilie, die die Superoxidradikal-Dismutation in molekularen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid katalysieren, sowie verschiedene Katalasen und Peroxidasen, die den antioxidativen Pool (Glutathion, NADPH, Peroxiredoxin, Thioredoxin^7,8) nutzen^, um die anschließende Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff zu katalysieren.

Mehrere Berichte unterstützen jedoch die Rolle von ROS als Schlüsselkomponenten molekularer Schaltkreise, die kritische Zellfunktionen regulieren, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Mobilität ^2,3,4. Dieses Konzept wird durch die anfängliche Identifizierung und Charakterisierung von ROS-produzierenden Mechanismen in aeroben Organismen, einschließlich Lipoxygenasen, Cyclooxygenasen und NADPH-Oxidasen, weiter unterstützt ^9,10. In diesem Sinne spielen ROS eine aktive Rolle während der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren 11,12,13 und Schlüsselrollen für diese Moleküle bei der Regulation spezifischer physiologischer In-vivo-Funktionen wurden in verschiedenen experimentellen Systemen beschrieben, einschließlich des Differenzierungsprogramms von hämatopoetischen Vorläuferzellen in Drosophila^14, der heilenden Induktion bei Zebrafischen oder der Schwanzregeneration bei Xenopus-Kaulquappen ¹⁵. Bei Säugetieren waren ROS am Selbsterneuerungs-/Differenzierungspotenzial von neuralen Stammzellen in einem Neurosphärenmodell^{beteiligt 16} und an der Deregulierung der intestinalen Stammzellfunktion während der Darmkrebsentstehung¹⁷. In der Haut wurde die ROS-Signalgebung mit der epidermalen Differenzierung und der Regulierung der Hautstammzellnische und des Wachstumszyklus der Haarfollikel in Verbindung gebracht^18,19.

In dieser Perspektive ist eine wesentliche experimentelle Einschränkung zur Bestimmung der physiologischen Rolle von ROS in biologischen Systemen, sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen, das Fehlen geeigneter experimenteller Werkzeuge, um eine kontrollierte Produktion dieser Moleküle in Zellen und Geweben zu induzieren, die ihrer physiologischen Produktion als sekundäre Signalboten genau ähneln. Derzeit beinhalten die meisten experimentellen Ansätze die Verabreichung von exogenen ROS, meist in Form von Wasserstoffperoxid. Wir haben kürzlich einen experimentellen Ansatz implementiert, um eine transiente, nicht-letale In-vivo-Produktion von endogenen ROS in der Maushaut einzuschalten, basierend auf der Verabreichung von Vorläufern des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX (PpIX; z.B. Aminolaevulinsäure oder ihr Methylderivat Methylaminolevulinat) und einer weiteren Bestrahlung der Probe mit rotem Licht, um die in situ Bildung von ROS aus intrazellulärem molekularem Sauerstoff zu induzieren (Abbildung 1). Dieses photodynamische Verfahren kann effizient genutzt werden, um residente Stammzellnischen zu stimulieren, wodurch die Regenerationsprogramme des Gewebes aktiviert^{werden 19,20} und der Weg für neue therapeutische Modalitäten in der regenerativen Hautmedizin eröffnet wird. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung des Protokolls und zeigen repräsentative Beispiele für die Stimulation von Stammzellnischen, gemessen als Erhöhung der Anzahl von Langzeit-5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU)-Markierungsretentionszellen (LRCs) in der Wölbungsregion des Haarfollikels^19,21 und die anschließende Aktivierung von Regenerationsprogrammen (Beschleunigung des Haarwachstums und der Heilung von Verbrennungen), die durch transiente^, nicht-letale ROS-Produktion in der Haut des C57Bl6-Mausstamms.

Protocol

Alle Mäusehaltungs- und Versuchsverfahren müssen in Übereinstimmung mit den lokalen, nationalen und internationalen Gesetzen und Richtlinien für Tierversuche durchgeführt werden. 1. Induktion des Haarwachstums, Induktion von Verbrennungen und Identifizierung langfristiger BrdU-LRCs in den Schwanzhautepithel-Wholemounts HINWEIS: Verwenden Sie 10 Tage oder 7 Wochen alte C57BL/6-Mäuse, vorzugsweise Wurfgeschwister, für die unten beschriebenen Versuchspläne. Bei a…

Representative Results

Die topische Verabreichung des mALA-Vorläufers in die Rücken- und Schwanzhaut der Maus führt zu einer signifikanten Akkumulation von PpIX im gesamten Gewebe und spürbar im Haarfollikel, wie die rötlich-rosa Fluoreszenz dieser Verbindung unter blauer Lichtanregung (407 nm) zeigt (Abbildung 2A,C). Die anschließende Bestrahlung des behandelten Gewebes mit rotem Licht (636 nm) bei einer Fluenz von 2,5−4 J/cm2 fördert die vorübergehende Produktion von ROS im …

Discussion

In dieser Arbeit stellen wir eine Methodik vor, die eine transiente Aktivierung der endogenen ROS-Produktion in vivo in der Haut von Mäusen mit physiologischen Effekten ermöglicht. Die Methodik basiert auf einem photodynamischen Verfahren, um eine kontrollierte und lokale Stimulation des endogenen Photosensibilisators PpIX zu induzieren (Abbildung 1B). Dieser experimentelle Ansatz ist ein interessantes Werkzeug zur Untersuchung der ROS-Biologie in In-vivo-Versuchssystemen, der einen signif…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA