Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die vorübergehende In-vivo-Produktion von nicht-letalen Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen zu induzieren und so die physiologischen Reaktionen im Gewebe weiter zu fördern.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur induzierbaren in vivo Photogenerierung von endogenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen. Diese transiente Produktion von ROS in situ aktiviert effizient die Zellproliferation in Stammzellnischen und stimuliert die Geweberegeneration, was sich stark in der Beschleunigung von Verbrennungsheilungs- und Haarfollikelwachstumsprozessen manifestiert. Das Protokoll basiert auf einer regulierbaren photodynamischen Behandlung, bei der das Gewebe mit Vorstufen des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX behandelt und das Gewebe unter streng kontrollierten physikalisch-chemischen Parametern weiter mit rotem Licht bestrahlt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll ein interessantes experimentelles Werkzeug zur Analyse der ROS-Biologie dar.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind das Ergebnis der chemischen Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser und umfassen Singulett-Sauerstoff, Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid und das Hydroxylradikal ^1,2,3. ROS haben aufgrund ihrer extrem chemisch reaktiven Natur eine sehr kurze Lebensdauer. In aeroben Organismen werden ROS zufällig in den Zellen als großes undichtes Nebenprodukt der aeroben Atmung (Elektronentransportkette) in den Mitochondrien gebildet. Die vorübergehende Anhäufung hoher ROS-Konzentrationen in der Zelle führt zu einem oxidativen Stresszustand, der d....

Protokoll

Alle Mäusehaltungs- und Versuchsverfahren müssen in Übereinstimmung mit den lokalen, nationalen und internationalen Gesetzen und Richtlinien für Tierversuche durchgeführt werden.

1. Induktion des Haarwachstums, Induktion von Verbrennungen und Identifizierung langfristiger BrdU-LRCs in den Schwanzhautepithel-Wholemounts

HINWEIS: Verwenden Sie 10 Tage oder 7 Wochen alte C57BL/6-Mäuse, vorzugsweise Wurfgeschwister, für die unten beschriebenen Versuchspläne. Bei allen experimentellen Verfahren werden die Tiere durch 3%ige Isofluran-Inhalation betäubt oder durch Zervixluxation euthanasiert, wie angegeben.

1. In....

Ergebnisse

Die topische Verabreichung des mALA-Vorläufers in die Rücken- und Schwanzhaut der Maus führt zu einer signifikanten Akkumulation von PpIX im gesamten Gewebe und spürbar im Haarfollikel, wie die rötlich-rosa Fluoreszenz dieser Verbindung unter blauer Lichtanregung (407 nm) zeigt (Abbildung 2A,C). Die anschließende Bestrahlung des behandelten Gewebes mit rotem Licht (636 nm) bei einer Fluenz von 2,5−4 J/^cm2 fördert die vorübergehende Produktion von ROS im Gewebe, in.......

Diskussion

In dieser Arbeit stellen wir eine Methodik vor, die eine transiente Aktivierung der endogenen ROS-Produktion in vivo in der Haut von Mäusen mit physiologischen Effekten ermöglicht. Die Methodik basiert auf einem photodynamischen Verfahren, um eine kontrollierte und lokale Stimulation des endogenen Photosensibilisators PpIX zu induzieren (Abbildung 1B). Dieser experimentelle Ansatz ist ein interessantes Werkzeug zur Untersuchung der ROS-Biologie in In-vivo-Versuchssystemen, der einen signifik.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2′,7′-Dichlorfluorescindiacetat	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridin	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridin-Fluorescein	Roche	11202693001
Enthaarungscreme (z.B. Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In-Vivo-Bildgebungssystem, z. B. IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in Form einer topischen Creme, z. B. METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power Energiemessgerät (z. B. ThorLabs Modell PM100D)	ThorLabs
Rote Lichtquelle, z. B. 636 nm Aktilite LED-Lampe	Photocure ASA