Стимуляция ниш стволовых клеток и регенерация тканей в коже мышей с помощью переключаемой протопорфирина IX-зависимой фотогенерации активных форм кислорода in situ
Summary
Целью этого протокола является индуцирование транзиторной in vivo продукции нелетальных уровней активных форм кислорода (АФК) в коже мышей, что способствует дальнейшему развитию физиологических реакций в тканях.
Abstract
В данной статье мы опишем протокол индуцирования переключаемой фотогенерации in vivo эндогенных активных форм кислорода (АФК) в коже мышей. Эта транзиторная продукция АФК in situ эффективно активирует пролиферацию клеток в нишах стволовых клеток и стимулирует регенерацию тканей, что сильно проявляется через ускорение процессов заживления ожогов и роста волосяных фолликулов. Протокол основан на регулируемом фотодинамическом лечении, которое обрабатывает ткань предшественниками эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX и далее облучает ткань красным светом при строго контролируемых физико-химических параметрах. В целом, этот протокол представляет собой интересный экспериментальный инструмент для анализа биологии АФК.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) являются результатом химического восстановления молекулярного кислорода с образованием воды и включают синглетный кислород, супероксид-анион, перекись водорода и гидроксильный радикал 1,2,3. АФК имеют очень короткий срок службы из-за их чрезвычайно химически активной природы. У аэробных организмов АФК случайно образуются внутри клеток как основной побочный продукт аэробного дыхания (цепь переноса электронов) в митохондриях. Временное накопление высоких уровней АФК в клетке приводит к окислительному стрессу, который может спровоцировать необратимую инактивацию белков, липидов и сахаров и введение мутаций в молекулу ДНК 2,3,4,5. Постепенное накопление окислительных повреждений в клетках, тканях и целых организмах неуклонно возрастает с течением времени и связано с индукцией программ клеточной гибели, некоторыми патологиями и процессом старения 2,3,4,6.
Аэробные организмы неуклонно развивают эффективные молекулярные механизмы для борьбы с избыточным накоплением АФК в клетках и тканях. Эти механизмы включают членов семейства белков супероксиддисмутазы (СОД), которые катализируют радикальную дисмутацию супероксида в молекулярный кислород и перекись водорода, а также различные каталазы и пероксидазы, которые используют антиоксидантный пул (глутатион, НАДФН, пероксиредоксин, тиоредоксин 7,8) для катализа последующего превращения перекиси водорода в воду и молекулярный кислород.
Тем не менее, в нескольких отчетах подтверждается роль АФК в качестве ключевых компонентов молекулярных цепей, регулирующих важнейшие функции клеток, включая пролиферацию, дифференцировку и подвижность 2,3,4. Эта концепция также подтверждается первоначальной идентификацией и характеристикой специализированных механизмов, продуцирующих АФК в аэробных организмах, включая липоксигеназы, циклооксигеназы и НАДФН-оксидазы 9,10. В этом смысле АФК играют активную роль в развитии эмбрионов позвоночных 11,12,13, и ключевые роли этих молекул в регуляции специфических физиологических функций in vivo были описаны в различных экспериментальных системах, включая программу дифференцировки гемопоэтических предшественников у дрозофилы14, индукцию заживления у рыбок данио или регенерацию хвоста у головастиков Xenopus 15. У млекопитающих АФК участвуют в потенциале самообновления/дифференцировки нейральных стволовых клеток в нейросферной модели16 и в дерегуляции функции кишечных стволовых клеток во время инициации колоректального рака17. В коже передача сигналов АФК связана с эпидермальной дифференцировкой и регуляцией ниши стволовых клеток кожи и циклом роста волосяных фолликулов18,19.
С этой точки зрения, основным экспериментальным ограничением для определения физиологической роли АФК в биологических системах, как в нормальных, так и в патологических условиях, является отсутствие адекватных экспериментальных инструментов для индуцирования контролируемой продукции этих молекул в клетках и тканях, точно напоминающих их физиологическую продукцию в качестве вторичных сигнальных мессенджеров. В настоящее время большинство экспериментальных подходов предполагают введение экзогенных АФК, в основном в виде перекиси водорода. Недавно мы реализовали экспериментальный подход к включению транзиторной, нелетальной in vivo продукции эндогенных АФК в коже мышей, основанный на введении предшественников эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX (PpIX; например, аминолаэвулиновой кислоты или ее метилпроизводного метиламинолевулината) и последующем облучении образца красным светом для индуцирования in situ образования АФК из внутриклеточного молекулярного кислорода (рис. 1). Эта фотодинамическая процедура может быть эффективно использована для стимуляции резидентных ниш стволовых клеток, тем самым активируя регенеративные программы тканей19,20 и открывая путь для новых терапевтических методов в регенеративной медицине кожи. Здесь мы представляем подробное описание протокола, показывающее репрезентативные примеры стимуляции ниш стволовых клеток, измеряемой как увеличение количества долговременных клеток, удерживающих метку 5-бром-2′-дезоксиуридина (BrdU) в области выпуклости волосяного фолликула19,21, и последующей активации программ регенерации (ускорение роста волос и процессов заживления ожогов), индуцированных транзиторными, нелетальная продукция АФК в коже мышей линии C57Bl6.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе мы представляем методологию, которая позволяет осуществлять транзиторную активацию продукции эндогенных АФК in vivo в коже мышей с физиологическими эффектами. Методика основана на фотодинамической процедуре индуцирования контролируемой и локальной стимуляции эндогенн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Министерства экономики и конкуренции (RTC-2014-2626-1 для JE) и Института Салуда Карлоса III (PI15/01458 для JE) Испании. ЕК получила поддержку гранта Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid и UAM).
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -. H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, &. #. 1. 9. 3. ;., Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -. C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
