Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Summary

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Abstract

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir fotogeração in vivo comutável de espécies reativas endógenas de oxigênio (ROS) em pele de camundongos. Essa produção transitória de ERO in situ ativa eficientemente a proliferação celular em nichos de células-tronco e estimula a regeneração tecidual, fortemente manifestada através da aceleração dos processos de cicatrização de queimaduras e crescimento de folículos pilosos. O protocolo é baseado em um tratamento fotodinâmico regulável que trata o tecido com precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX e irradia o tecido com luz vermelha sob parâmetros físico-químicos rigorosamente controlados. De modo geral, este protocolo constitui uma ferramenta experimental interessante para analisar a biologia das EROs.

Introduction

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são o resultado da redução química do oxigênio molecular para formar água, e incluem o oxigênio singlete, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila ^1,2,3. As ROS têm uma vida útil muito curta devido à sua natureza extremamente química reativa. Em organismos aeróbios, as ERO são formadas incidentalmente no interior das células como um importante subproduto da respiração aeróbica (cadeia de transporte de elétrons) nas mitocôndrias. O acúmulo transitório de altos níveis de ERO na célula resulta em uma condição de estresse oxidativo que pode provocar a inativação irreversível de proteínas, lipídios e açúcares e a introdução de mutações na molécula de DNA 2,3,4,5. O acúmulo gradual de dano oxidativo em células, tecidos e organismos inteiros aumenta progressivamente com o tempo e tem sido associado à indução de programas de morte celular, diversas patologias e ao processo de envelhecimento 2,3,4,6.

Os organismos aeróbios têm desenvolvido constantemente mecanismos moleculares eficientes para combater o acúmulo excessivo de ERO em células e tecidos. Esses mecanismos incluem membros da família de proteínas superóxido dismutase (SOD), que catalisam a dismutação do radical superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio, bem como diferentes catalases e peroxidases que utilizam o pool antioxidante (glutationa, NADPH, peroxirredoxina, tiorredoxina ^7,8) para catalisar a subsequente conversão de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular.

No entanto, vários relatos suportam o papel das ROS como componentes-chave de circuitos moleculares que regulam funções celulares críticas, incluindo proliferação, diferenciação e^{mobilidade2,3,4}. Esse conceito é ainda apoiado pela identificação e caracterização inicial de mecanismos dedicados produtores de ERO em organismos aeróbios, incluindo lipoxigenases ciclooxigenases e NADPH oxidases ^9,10. Nesse sentido, as ERO exibem um papel ativo durante o desenvolvimento embrionário de vertebrados 11,12,13 e papéis fundamentais para essas moléculas na regulação de funções fisiológicas específicas in vivo têm sido relatados em diferentes sistemas experimentais, incluindo o programa de diferenciação de progenitores hematopoéticos em Drosophila^14, indução de cura em zebrafish ou regeneração da cauda em girinos de Xenopus ¹⁵. Em mamíferos, as ROS têm sido envolvidas no potencial de auto-renovação/diferenciação de células-tronco neurais em um modelo de neuroesfera¹⁶ e na desregulação da função das células-tronco intestinais durante o início do câncer colorretal¹⁷. Na pele, a sinalização das ERO tem sido associada à diferenciação epidérmica e à regulação do nicho de células-tronco cutâneas e do ciclo de crescimento dos folículos pilosos^18,19.

Nessa perspectiva, uma grande limitação experimental para determinar os papéis fisiológicos das ROS em sistemas biológicos, tanto em condições normais quanto patológicas, é a falta de ferramentas experimentais adequadas para induzir a produção controlada dessas moléculas em células e tecidos, assemelhando-se com precisão à sua produção fisiológica como mensageiros de segunda sinalização. Atualmente, a maioria das abordagens experimentais envolve a administração de ERO exógenas, principalmente na forma de peróxido de hidrogênio. Recentemente, implementamos uma abordagem experimental para ativar uma produção in vivo transitória e não letal de ROS endógenas na pele de camundongos, baseada na administração de precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX (PpIX; por exemplo, ácido aminolaevulínico ou seu derivado metílico metilaminolevulinato) e posterior irradiação da amostra com luz vermelha para induzir a formação in situ de ROS a partir de oxigênio molecular intracelular (Figura 1). Esse procedimento fotodinâmico pode ser eficientemente utilizado para estimular nichos de células-tronco residentes, ativando os programas regenerativos do tecido^19,20 e abrindo caminho para novas modalidades terapêuticas na medicina regenerativa da pele. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo, mostrando exemplos representativos de estimulação de nichos de células-tronco, medida como um aumento no número de células de retenção de marcação (LRCs) de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) a longo prazo na região do abaulamento do folículo piloso^19,21, e subsequente ativação de programas de regeneração (aceleração do crescimento do cabelo e processos de cicatrização de queimaduras) induzidos por produção não letal de ERO na pele da linhagem C57Bl6 de camundongos.

Protocol

Todos os procedimentos de criação e experimentação de camundongos devem ser conduzidos em conformidade com a legislação local, nacional, internacional e diretrizes sobre experimentação animal. 1. Indução do crescimento de pelos, indução de queimaduras e identificação de LRCs de BrdU a longo prazo no epitélio da pele da cauda íntegra NOTA: Utilizar camundongos C57BL/6 com 10 dias ou 7 semanas de idade, preferencialmente ninhadas, para os planejamentos e…

Representative Results

A administração tópica do precursor mALA na pele do dorso e da cauda de camundongos resulta em acúmulo significativo de PpIX em todo o tecido e, visivelmente, no folículo piloso, como demonstrado pela fluorescência vermelho-rósea desse composto sob excitação à luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha (636 nm) a uma fluência de 2,5−4 J/cm2 promove a produção transitória de ERO no tecido, particul…

Discussion

Aqui, apresentamos uma metodologia que permite uma ativação transitória da produção endógena de ERO in vivo em pele de camundongo com efeitos fisiológicos. A metodologia baseia-se em um procedimento fotodinâmico para induzir uma estimulação local e controlada do fotossensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Esta abordagem experimental é uma ferramenta interessante para estudar a biologia de ROS em sistemas experimentais in vivo, constituindo um avanço significativo sobre metodo…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA