Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde
Summary
Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.
Abstract
Burada, fare derisinde endojen reaktif oksijen türlerinin (ROS) değiştirilebilir in vivo fotojenerasyonunu indüklemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu geçici ROS in situ üretimi, kök hücre nişlerinde hücre proliferasyonunu etkili bir şekilde aktive eder ve yanık iyileşmesinin ve saç folikülü büyüme süreçlerinin hızlanmasıyla güçlü bir şekilde ortaya çıktığı gibi doku yenilenmesini uyarır. Protokol, dokuyu endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX’un öncülleri ile tedavi eden ve ayrıca sıkı bir şekilde kontrol edilen fizikokimyasal parametreler altında dokuyu kırmızı ışıkla ışınlayan düzenlenebilir bir fotodinamik tedaviye dayanmaktadır. Genel olarak, bu protokol ROS biyolojisini analiz etmek için ilginç bir deneysel araç oluşturmaktadır.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS), moleküler oksijenin su oluşturmak üzere kimyasal indirgenmesinin sonucudur ve singlet oksijen, süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali 1,2,3’ü içerir. ROS, son derece kimyasal reaktif yapıları nedeniyle çok kısa bir ömre sahiptir. Aerobik organizmalarda, ROS, mitokondrideki aerobik solunumun (elektron taşıma zinciri) önemli bir sızdıran yan ürünü olarak hücrelerin içinde tesadüfen oluşur. Hücrede yüksek seviyelerde ROS’un geçici olarak birikmesi, proteinlerin, lipitlerin ve şekerlerin geri dönüşümsüz inaktivasyonunu ve DNA molekülündemutasyonların ortaya çıkmasına neden olabilecek oksidatif bir stres durumuna neden olur 2,3,4,5. Hücrelerde, dokularda ve tüm organizmalarda oksidatif hasarın kademeli birikimi zamanla istikrarlı bir şekilde artar ve hücre ölüm programlarının, çeşitli patolojilerin ve yaşlanma sürecininindüksiyonu ile ilişkilendirilmiştir 2,3,4,6.
Aerobik organizmalar, hücrelerde ve dokularda aşırı ROS birikiminin üstesinden gelmek için sürekli olarak verimli moleküler mekanizmalar geliştirmiştir. Bu mekanizmalar, süperoksit radikal dismutasyonunu moleküler oksijen ve hidrojen peroksite katalize eden süperoksit dismutaz (SOD) protein ailesinin üyelerini ve ayrıca hidrojen peroksitin daha sonra suya ve moleküler oksijene dönüşümünü katalize etmek için antioksidan havuzu (glutatyon, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin 7,8) kullanan farklı katalazları ve peroksidazları içerir.
Bununla birlikte, birkaç rapor, ROS’un proliferasyon, farklılaşma ve hareketlilikdahil olmak üzere kritik hücre fonksiyonlarını düzenleyen moleküler devrelerin temel bileşenleri olarak rolünü desteklemektedir 2,3,4. Bu kavram, lipoksijenazlar, siklooksijenazlar ve NADPH oksidazlar 9,10 dahil olmak üzere aerobik organizmalarda özel ROS üreten mekanizmaların ilk tanımlanması ve karakterizasyonu ile daha da desteklenmektedir. Bu anlamda, ROS omurgalı embriyo gelişimi sırasında aktif bir rol sergiler 11,12,13 ve bu moleküllerin spesifik in vivo fizyolojik fonksiyonların düzenlenmesinde kilit rolleri, Drosophila14’te hematopoietik progenitörlerin farklılaşma programı, zebra balıklarında iyileşme indüksiyonu veya Xenopus kurbağa yavrularında kuyruk rejenerasyonu 15 dahil olmak üzere farklı deneysel sistemlerde bildirilmiştir . Memelilerde ROS, bir nörosfer modelinde16 nöral kök hücrelerin kendi kendini yenileme / farklılaşma potansiyelinde ve kolorektal kanser başlangıcı sırasında bağırsak kök hücre fonksiyonunun deregülasyonunda17 rol oynamıştır. Deride, ROS sinyalizasyonu epidermal farklılaşma ve cilt kök hücre nişinin ve saç folikülü büyüme döngüsünündüzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir 18,19.
Bu perspektifte, hem normal hem de patolojik koşullarda biyolojik sistemlerde ROS’un fizyolojik rollerini belirlemek için önemli bir deneysel sınırlama, bu moleküllerin hücrelerde ve dokularda kontrollü üretimini indüklemek için yeterli deneysel araçların bulunmamasıdır. Şu anda, çoğu deneysel yaklaşım, çoğunlukla hidrojen peroksit formunda eksojen ROS uygulamasını içermektedir. Yakın zamanda, endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX’un öncüllerinin uygulanmasına dayanan fare derisinde geçici, öldürücü olmayan bir in vivo endojen ROS üretimini açmak için deneysel bir yaklaşım uyguladık (PpIX; ör., aminolaevulinik asit veya metil türevi metilaminolevulinat) ve hücre içi moleküler oksijenden yerinde ROS oluşumunu indüklemek için numunenin kırmızı ışıkla daha fazla ışınlanması (Şekil 1). Bu fotodinamik prosedür, yerleşik kök hücre nişlerini uyarmak için etkili bir şekilde kullanılabilir, böylece dokunun rejeneratif programlarını aktive eder 19,20 ve ciltrejeneratif tıbbında yeni terapötik modalitelerin yolunu açar. Burada, saç folikülünün19,21 çıkıntı bölgesindeki uzun süreli 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) etiket tutucu hücrelerin (LRC’ler) sayısındaki artış olarak ölçülen, kök hücre nişlerinin uyarılmasının temsili örneklerini gösteren protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz ve ardından geçici olarak indüklenen rejenerasyon programlarının aktivasyonu (saç büyümesinin hızlanması ve yanık iyileşme süreçleri), C57Bl6 fare suşunun derisinde öldürücü olmayan ROS üretimi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, fare derisinde fizyolojik etkilerle in vivo endojen ROS üretiminin geçici aktivasyonuna izin veren bir metodoloji sunuyoruz. Metodoloji, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX’in kontrollü ve lokal bir stimülasyonunu indüklemek için fotodinamik bir prosedüre dayanmaktadır (Şekil 1B). Bu deneysel yaklaşım, ROS biyolojisini in vivo deneysel sistemlerde incelemek için ilginç bir araçtır ve harici ROS kaynakları (genellikle hidrojen peroksit) kullanan metodolojiler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İspanya’dan Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1’den JE’ye) ve Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458’den JE’ye) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. EC, Atracción de Talento Investigador hibesi 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid ve UAM) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -. H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, &. #. 1. 9. 3. ;., Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -. C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
