切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生
Summary
このプロトコルの目的は、マウスの皮膚で非致死レベルの活性酸素種(ROS)の一時的なin vivo産生を誘導し、組織内の生理学的応答をさらに促進することです。
Abstract
ここでは、マウス皮膚において内因性活性酸素種(ROS)の切り替え可能なin vivo光生成を誘導するためのプロトコルについて述べる。この一過性のROSのin situ産生は、幹細胞ニッチにおける細胞増殖を効率的に活性化し、熱傷治癒および毛包成長プロセスの促進を通じて強く現れる組織再生を刺激する。このプロトコルは、内因性光増感剤プロトポルフィリンIXの前駆体で組織を処理し、さらに厳密に制御された物理化学的パラメータの下で組織に赤色光を照射する調節可能な光線力学治療に基づいています。全体として、このプロトコルは、ROS生物学を分析するための興味深い実験ツールを構成します。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、分子状酸素を化学的に還元して水を形成した結果であり、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカル1,2,3が含まれます。ROSは、その非常に化学的反応性のために非常に短い寿命を有する。好気性生物では、ミトコンドリアの好気性呼吸(電子伝達系)の主要な漏出性副産物として、ROSが細胞内に偶然形成されます。細胞内の高レベルのROSの一時的な蓄積は、タンパク質、脂質および糖の不可逆的な不活性化およびDNA分子における突然変異の導入を引き起こす可能性のある酸化ストレス状態をもたらす2,3,4,5。細胞、組織、および生物全体における酸化的損傷の漸進的な蓄積は、時間とともに着実に増加し、細胞死プログラムの誘導、いくつかの病状、および老化プロセスに関連しています2,3,4,6。
好気性生物は、細胞や組織における過剰なROS蓄積に対処するための効率的な分子機構を着実に進化させてきました。これらのメカニズムには、分子状酸素と過酸化水素へのスーパーオキシドラジカル変異を触媒するスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)タンパク質ファミリーのメンバー、および抗酸化プールを使用するさまざまなカタラーゼとペルオキシダーゼ(グルタチオン、NADPH、ペルオキシレドキシン、チオレドキシン7,8)が含まれますその後の過酸化水素の水および分子状酸素への変換を触媒します。
しかし、いくつかの報告は、増殖、分化、移動性などの重要な細胞機能を調節する分子回路の重要な構成要素としてのROSの役割を支持しています2,3,4。この概念は、リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、NADPHオキシダーゼなど、好気性生物における専用のROS産生メカニズムの初期同定と特性評価によってさらに裏付けられています9,10。この意味で、ROSは脊椎動物の胚発生中に積極的な役割を果たし11、12、13、ショウジョウバエの造血前駆細胞の分化プログラム14、ゼブラフィッシュの治癒誘導、アフリカツメガエルの尾の再生など、さまざまな実験系で報告されています15.哺乳類では、ROSはニューロスフェアモデルにおける神経幹細胞の自己複製/分化能16および結腸直腸癌開始時の腸幹細胞機能の調節解除に関与しています17。皮膚では、ROSシグナル伝達は表皮分化と皮膚幹細胞ニッチおよび毛包成長サイクルの調節に関連しています18,19。
この観点から、正常状態または病理学的状態の両方における生物学的システムにおけるROSの生理学的役割を決定するための主要な実験的制限は、細胞および組織におけるこれらの分子の制御された産生を誘導するための適切な実験ツールの欠如であり、それらの生理学的産生に正確に類似しています第二のシグナル伝達メッセンジャーとして。現在、ほとんどの実験的アプローチは、主に過酸化水素の形での外因性ROSの投与を含む。我々は最近、内因性光増感剤プロトポルフィリンIX(PpIX;例えば、アミノラエブリン酸またはそのメチル誘導体メチルアミノレブリン酸)の前駆体を投与し、さらに赤色光を試料に照射して細胞内分子状酸素からのROSのその場形成を誘導することに基づいて、マウス皮膚における内因性ROSの一過性の非致死性in vivo産生をオンにする実験的アプローチを実施した(図1).この光線力学的手順は、常在する幹細胞ニッチを刺激するために効率的に使用され得、したがって、組織の再生プログラムを活性化し19、20、皮膚再生医療における新しい治療モダリティへの道を開く。ここでは、毛包19,21のバルジ領域における長期の5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)標識保持細胞(LRC)の数の増加、およびその後の一過性によって誘発される再生プログラムの活性化(発毛および火傷治癒プロセスの加速)として測定される幹細胞ニッチの刺激の代表例を示すプロトコルの詳細な説明を提示します。 C57Bl6マウス系統の皮膚における非致死性ROS産生。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、マウス皮膚における生体内の内因性ROS産生を一過性に活性化させ、生理的効果を発揮する方法論を提示する。この方法論は、内因性光増感剤PpIXの制御された局所刺激を誘導するための光力学的手順に基づいている(図1B)。この実験的アプローチは、in vivo実験システムでROS生物学を研究するための興味深いツールであり、外部ROS源(通常は過酸化水素)を使用し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スペインの経済経済大臣(RTC-2014-2626-1からJE)およびサルドカルロスIII研究所(PI15/01458からJE)からの助成金によってサポートされています。ECは、Atracción de Talento Investigador grant 2017-T2/BMD-5766(Comunidad de Madrid and UAM)の支援を受けています。
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
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