このプロトコルの目的は、マウスの皮膚で非致死レベルの活性酸素種(ROS)の一時的なin vivo産生を誘導し、組織内の生理学的応答をさらに促進することです。
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方法論記事
切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生
この記事について
サマリー
要約
ここでは、マウス皮膚において内因性活性酸素種(ROS)の切り替え可能なin vivo光生成を誘導するためのプロトコルについて述べる。この一過性のROSのin situ産生は、幹細胞ニッチにおける細胞増殖を効率的に活性化し、熱傷治癒および毛包成長プロセスの促進を通じて強く現れる組織再生を刺激する。このプロトコルは、内因性光増感剤プロトポルフィリンIXの前駆体で組織を処理し、さらに厳密に制御された物理化学的パラメータの下で組織に赤色光を照射する調節可能な光線力学治療に基づいています。全体として、このプロトコルは、ROS生物学を分析するための興味深い実験ツールを構成します。
概要
活性酸素種(ROS)は、分子状酸素を化学的に還元して水を形成した結果であり、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカル1,2,3が含まれます。ROSは、その非常に化学的反応性のために非常に短い寿命を有する。好気性生物では、ミトコンドリアの好気性呼吸(電子伝達系)の主要な漏出性副産物として、ROSが細胞内に偶然形成されます。細胞内の高レベルのROSの一時的な蓄積は、タンパク質、脂質および糖の不可逆的な不活性化およびDNA分子における突然変異の導入を引き起こす可能性のある酸化ストレス状態をもたらす2,3,4,5。細胞、組織、および生物全体における酸化的損傷の漸進的な蓄積は、時間とともに着実に増加し、細胞死プログラムの誘導、いくつかの病状、および老化プロセスに関連しています2,3,4,6。
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プロトコル
すべてのマウス飼育および実験手順は、動物実験に関する地域、国内、国際的な法律およびガイドラインに準拠して実施する必要があります。
1.発毛の誘導、熱傷の誘発、および尾部皮膚上皮全体における長期BrdU LRCの同定
注:以下に説明する実験計画には、10日齢または7週齢のC57BL / 6マウス、できれば同腹仔を使用してください。すべての実験手順において、動物は3%イソフルラン吸入によって麻酔されるか、示されているように頸部脱臼によって安楽死させられます。
- 第2休止期(生後約50日目)におけるマウスの背部皮膚における発毛の誘導
- 3%イソフルランを吸入してマウスに麻酔をかける。ペダル反射の欠如(しっかりとしたつま先をつまむ)によって完全な深部麻酔を確認します。バリカンと脱毛クリームを使用して、各マウスの背中の皮膚の2つの独立した横並びの領域を剃ります(材料表)。左側をコントロールに、右側を治療に使用します。
注:剃毛後、このマウス系統のメラニン形成と成長期(成長)期への参入の指標である灰色/黒ではなく、鉃毛後の背中の皮膚がピンクがかっていることを確認してください。 - PBSで完全に洗浄して、すべてのクリームの残りを取り除き、セクション2.1で説明されているように、非致死性ROSレベルの一過性のin situ産生の誘導に進みます。.<....
- 3%イソフルランを吸入してマウスに麻酔をかける。ペダル反射の欠如(しっかりとしたつま先をつまむ)によって完全な深部麻酔を確認します。バリカンと脱毛クリームを使用して、各マウスの背中の皮膚の2つの独立した横並びの領域を剃ります(材料表)。左側をコントロールに、右側を治療に使用します。
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結果
マウスの背中と尾の皮膚にmALA前駆体を局所投与すると、青色光(407 nm)励起下でのこの化合物の赤みがかったピンク色の蛍光によって示されるように、組織全体、そして顕著なことに毛包にPpIXが有意に蓄積されます(図2A、C)。その後、2.5−4 J/cm 2のフルエンスで赤色光(636 nm)を治療した組織に照射すると、組織、特に毛包のバルジ領域におけるROSの一時的な産生が促進されます(図2B、D)。
in vivoでマウスの皮膚で非致死性ROS産生をオンにすると、光治療の2日後に毛包のバルジ領域にある体性幹細胞に分類されるLRCの数が大幅に増加します(図3、左パネル)。特に、LRC数の増加は一過性であり、治療後6日で正常なレベルに戻ります(図3、右パネ.......
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ディスカッション
ここでは、マウス皮膚における生体内の内因性ROS産生を一過性に活性化させ、生理的効果を発揮する方法論を提示する。この方法論は、内因性光増感剤PpIXの制御された局所刺激を誘導するための光力学的手順に基づいている(図1B)。この実験的アプローチは、in vivo実験システムでROS生物学を研究するための興味深いツールであり、外部ROS源(通常は過酸化水素)を使用し、組織/サンプルでのROSの制御された局所的な産生を可能にする方法論よりも大きな進歩を構成します。
アミノレブリン酸ベースの前駆体が細胞内のPpIXの蓄積を促進するために過剰に投与されることを考えると、この方法論の重要なステップは、損傷閾値を下回るが強い刺激効果を示す組織内のROSレベルの一時的な産生を誘発するための適切な光線量の確立である。現在、細胞や組織で産生されるあらゆる種類のROSの正確な量を直接定量する技術はありません。私たちの方法論では、所与の光線量、産生されるROSの正確な量、および所与の生物学的効果(例えば、細胞死または細胞増殖)との間の直接的な相関.......
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開示事項
この作業で説明されている手順のすべての商用アプリケーションは、EC、MIC、およびJEによって作成され、商業的利用のためにDerma Innovate SLにライセンス供与されたCSIC-UAM特許(EP2932967A1)によって保護されています。JEとJJMは、Derma Innovate SLのアドバイザリーポジションを持っています。
謝辞
この研究は、スペインの経済経済大臣(RTC-2014-2626-1からJE)およびサルドカルロスIII研究所(PI15/01458からJE)からの助成金によってサポートされています。ECは、Atracción de Talento Investigador grant 2017-T2/BMD-5766(Comunidad de Madrid and UAM)の支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-ジクロロフルオレシンジアセテート | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-ブロモ-2'-脱酸素ウリジン | ΣAldrich | B5002-500MG | |
| 抗ブロモデオキシウリジン-フルオレセイン | ロシュ | 11202693001 | |
| 脱毛クリーム(例:Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivoイメージングシステム、例えば、局所クリームの形でのIVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA、例えば、METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| パワーエネルギーメーター(例:ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| 赤色光源、例えば、636 nm Aktilite LEDランプ | Photocure ASA |
参考文献
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Th....
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再版と許可
