Summary
该协议的目的是诱导小鼠皮肤中瞬时体内产生非致死水平的活性氧（ROS），进一步促进组织中的生理反应。
Abstract
在这里，我们描述了一种在小鼠皮肤中诱导内源性活性氧（ROS）的可切换体内光生的方案。这种原位ROS的瞬时产生有效地激活了干细胞壁龛中的细胞增殖，并刺激组织再生，这通过加速烧伤愈合和毛囊生长过程得到了强烈体现。该方案基于可调节的光动力处理，该处理用内源性光敏剂原卟啉IX的前体处理组织，并在严格控制的物理化学参数下进一步用红光照射组织。总体而言，该协议构成了分析ROS生物学的有趣实验工具。
Introduction
活性氧（ROS）是分子氧化学还原形成水的结果，包括单线态氧、超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基1,2,3。由于其极强的化学反应性，ROS的寿命非常短。在需氧生物中，ROS是在线粒体中有氧呼吸（电子传递链）的主要泄漏副产物在细胞内偶然形成的。细胞中高水平的ROS的瞬时积累导致氧化应激条件，可能导致蛋白质，脂质和糖的不可逆失活，并在DNA分子中引入突变2,3,4,5。细胞，组织和整个生物体中氧化损伤的逐渐积累随着时间的推移稳步增加，并且与细胞死亡程序，几种病理和衰老过程的诱导有关2,3,4,6。
需氧生物已经稳步进化出有效的分子机制，以解决细胞和组织中过量的ROS积累。这些机制包括超氧化物歧化酶（SOD）蛋白家族的成员，其催化超氧化物自由基歧化为分子氧和过氧化氢，以及不同的过氧化氢酶和过氧化物酶，它们使用抗氧化剂库（谷胱甘肽，NADPH，过氧化物还原蛋白，硫氧还蛋白7,8）催化随后过氧化氢转化为水和分子氧。
然而，一些报告支持ROS作为调节关键细胞功能的分子回路的关键组成部分的作用，包括增殖，分化和迁移2,3,4。这一概念得到了需氧生物中专用ROS产生机制的初步鉴定和表征的进一步支持，包括脂氧合酶环氧合酶和NADPH氧化酶9,10。从这个意义上说，ROS在脊椎动物胚胎发育过程中表现出积极作用11,12,13，并且这些分子在调节特定体内生理功能中的关键作用已在不同的实验系统中报道，包括果蝇14中造血祖细胞的分化程序，斑马鱼的愈合诱导或非洲爪蟾蝌蚪的尾部再生15.在哺乳动物中，ROS参与了神经球模型中神经干细胞的自我更新/分化潜力16，以及结直肠癌起始期间肠道干细胞功能的失调17。在皮肤中，ROS信号传导与表皮分化以及皮肤干细胞生态位和毛囊生长周期的调节有关18,19。
从这个角度来看，确定ROS在正常或病理条件下在生物系统中的生理作用的一个主要实验限制是缺乏足够的实验工具来诱导细胞和组织中这些分子的受控产生，准确地类似于它们作为第二信号信使的生理产生。目前，大多数实验方法涉及外源性ROS的施用，主要以过氧化氢的形式。我们最近实施了一种实验方法，以在小鼠皮肤中开启内源性，非致命的内源性ROS的体内产生，基于内源性光敏剂原卟啉IX的前体（PpIX;例如氨基拉伏林酸或其甲基衍生物甲氨基乙酰丙酸）的施用，并用红光进一步照射样品以诱导细胞内分子氧原位形成ROS（图1).这种光动力程序可以有效地用于刺激常驻干细胞生态位，从而激活组织的再生程序19,20，并为皮肤再生医学中的新治疗方式开辟道路。在这里，我们提供了该方案的详细描述，显示了刺激干细胞生态位的代表性示例，测量为毛囊19,21的凸起区域中长期5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记保留细胞（LRCs）数量的增加，以及随后由瞬态诱导的再生程序的激活（头发生长和烧伤愈合过程的加速）， C57Bl6小鼠品系皮肤中非致命ROS产生。
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Protocol
所有小鼠饲养和实验程序必须符合当地、国家、国际立法和动物实验指南。
1.诱导毛发生长，烧伤诱导和识别尾部皮肤上皮整体中的长期BrdU LRC
注意：使用10天或7周大的C57BL / 6小鼠，最好是同窝小鼠，用于下面描述的实验设计。在所有实验程序中，动物将通过3%异氟醚吸入麻醉或通过颈椎脱位安乐死，如所示。
- 在休止期（休息）阶段（出生后约50天）诱导小鼠背部皮肤的毛发生长
- 用吸入3%异氟醚麻醉小鼠。通过无踏板反射（脚趾用力捏）确认完全深度麻醉。使用理发器和脱毛膏在每只小鼠中剃除背部皮肤的两个独立的并排区域（材料表）。使用左侧进行对照，使用右侧进行治疗。
注意：检查剃须后，下颌背皮肤是否为粉红色而不是灰色/黑色，这是该小鼠品系黑色素生成和进入生长期（生长）阶段的指标。 - 用PBS彻底清洗以去除所有乳霜残留物，并按照第2.1节所述诱导非致命ROS水平的瞬时原位产生。
- 通过每天采集对照组和治疗后每只动物背部皮肤区域的高分辨率图像（例如，使用与5-20倍双目镜头耦合的高清摄像机）来记录毛囊生长。
- 用吸入3%异氟醚麻醉小鼠。通过无踏板反射（脚趾用力捏）确认完全深度麻醉。使用理发器和脱毛膏在每只小鼠中剃除背部皮肤的两个独立的并排区域（材料表）。使用左侧进行对照，使用右侧进行治疗。
- 在休止期（静息）阶段（出生后约50天）诱导小鼠背部皮肤中的2度烧 伤病变
- 麻醉小鼠。使用理发器和脱毛膏剃除每只小鼠的整个背部皮肤区域，并用PBS彻底清洗以去除所有乳霜残留物。
注意：在燃烧程序之前，在无菌盐水中原 位 皮下注射0.5%（2mg / ml）利多卡因，不超过7mg / ml。 - 浸入沸水中，在95°C下预热黄铜棒（横截面为1cm），然后在每只小鼠背背皮肤表面的中心区域施用5秒。
- 在烧伤产生后，腹膜内在电热毯上向动物注射1mL生理溶液（0.9%NaCl）以防止脱水。让动物恢复24小时，并按照第2.3节所述诱导非致命ROS水平的瞬时原位产生。
- 通过每天采集对照组和治疗过的每只动物背部皮肤区域的高分辨率图像（例如，使用与5-20倍双目镜头耦合的高清摄像机）来记录烧伤创面的进展。
- 麻醉小鼠。使用理发器和脱毛膏剃除每只小鼠的整个背部皮肤区域，并用PBS彻底清洗以去除所有乳霜残留物。
- 尾部皮肤上皮中长期BrdU LRC的产生和鉴定
- 腹膜内注射10/14天大的同窝伴侣（无麻醉），连续4天，将50mg / kg体重BrdU溶解在PBS中。在标记阶段之后，让小鼠在任何处理前生长50-60天。
注意：每次注射使用新针头。 - 按照第2.3节所述进行，在制备组织整体之前的不同时间诱导尾部皮肤中瞬时原位非致命ROS的产生。
- 为了准备整个尾巴表皮，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并用手术剪刀夹住尾巴。
- 用手术刀沿着尾巴做一个直的纵向切口，并将整个皮肤从脊椎上剥成一块。将剥落的皮肤在PBS中的5mM EDTA中在5mL管中的5mM EDTA中在37°C下孵育4小时，并使用镊子小心地将完整的表皮片与真皮分开。
- 在室温（RT）下将组织固定在PBS中的4%甲醛中至少72小时，并使用适当的抗体进行BrdU检测。
- 使用荧光/共聚焦显微镜来识别和量化每个实验条件下的LRC，包括在制备组织整体之前不同时间的光对照和光动力处理，如前所述详细描述19,20。
注意：固定表皮片可以在含有0.02%叠氮化钠的PBS中在4°C下储存长达三个月。固定表皮片可用于按照标准组织学切片程序对所需蛋白质进行免疫定位。
- 腹膜内注射10/14天大的同窝伴侣（无麻醉），连续4天，将50mg / kg体重BrdU溶解在PBS中。在标记阶段之后，让小鼠在任何处理前生长50-60天。
2.诱导小鼠皮肤中非致死性ROS水平的瞬时产生
注意：为了诱导小鼠皮肤中瞬时产生非致命ROS水平，将使用内源性光敏剂PpIX的前体进行光动力处理，在这种情况下，甲基氨基乙酰丙酸酯（mALA）和红光。
- 要开启瞬时ROS产生以诱导背部皮肤的毛发生长，请按照第1.1节中的说明准备动物。
- 在右侧区域以外用乳膏（材料表）的形式涂抹~25mg的mALA，保持左侧作为内部对照，避免个体间差异。在黑暗中孵育2.5小时，用PBS彻底洗掉多余的奶油。为了确认麻醉深度，每10分钟监测一次动物，直到完全恢复。
注意：背部皮肤中PpIX的产生应在蓝光（407 nm）激发下通过其红色荧光原位测试。 - 麻醉动物。
- 用足够的红光源照射整个背部皮肤（材料表），总剂量为2.5-4J / cm2。将小鼠放在电热毯上，直到它们完全恢复，并按照步骤1.1.3中所述进行。
注意：辐照度应通过操纵光源和组织之间的距离来调整，并使用功率能量计（材料表）进行测量。当在每只动物的任何独立剃光区域观察到毛发生长时，该实验被认为是完成的。整个过程只涉及一次照片处理。
- 在右侧区域以外用乳膏（材料表）的形式涂抹~25mg的mALA，保持左侧作为内部对照，避免个体间差异。在黑暗中孵育2.5小时，用PBS彻底洗掉多余的奶油。为了确认麻醉深度，每10分钟监测一次动物，直到完全恢复。
- 要开启瞬时 ROS 生产以改善2 度烧 伤病变的愈合，请按照第 1.2 节中的指示准备动物。
- 沿烧伤表面以外用乳膏的形式涂抹~25mg的mALA，包括约4mm的相邻组织。在黑暗中孵育2.5小时，用PBS彻底洗掉多余的奶油。为了确认麻醉深度，每10分钟监测一次动物，直到完全恢复。
- 麻醉动物。
- 用足够的红光源照射整个背部皮肤，总剂量为 2.5−4 J/cm2。将小鼠放在电热毯上，直到它们完全恢复，并按照步骤1.2.4中所述进行。
注意：当观察到完全烧伤愈合时，每只动物的实验程序被视为已完成。整个过程只涉及一次照片处理。
- 为了开启尾部皮肤中的瞬时ROS产生，如第1.3节所示制备小鼠，沿背侧组织区域以局部乳膏的形式施用~25mg的mALA，并按照第2.1节中所述进行背部皮肤。在动物安乐死前 24 小时、48 小时或 72 小时进行光处理和相应的光控制，并进一步提取尾部皮肤整个坐骑。
注意：在所有实验设计中，通过使用抗氧化剂ROS清除剂测定该过程的ROS依赖性（例如，通过在PBS中腹膜内注射20mg / mL溶液，pH 7.2，每天接种100mg / kg体重N-乙酰半胱氨酸，在mALA处理前5天开始，或者，在50%乙醇中加入两剂100mg / mL抗坏血酸， 间隔30分钟，在mALA治疗和红光照射之间的时间间隔内局部施用于皮肤）。
3. 皮肤中的ROS检测
- 使用氢乙啶进行光动力处理后尾部皮肤ROS产生的离体评估
注意：氢乙啶是一种非荧光分子，与ROS特异性反应产生荧光染料2-羟基乙锭（hET）。- 将如第1.3.3节所述获得的整个尾皮在37°C下在PBS溶液（对照样品）中的5mM EDTA中孵育3小时或另外含有2mM mALA（光动力处理样品）。
- 在所有情况下，从25mg / mL储备液中的二甲基亚砜（DMSO）中加入氢乙啶至终浓度为3.2μM，并在室温下在黑暗中孵育1小时。
- 用指尖将尾皮样品拉伸到玻璃表面上，并以 636 J/cm 2 的通量照射2 nm 红光。
- 立即进行将表皮与真皮分离，并按照第1.3.3节所述固定表皮片。
- 使用绿色激发光在荧光/共聚焦显微镜下评估hET红色发射，捕获高质量图像并进行进一步分析。
注意：在没有光动力处理的情况下使用组织样品的hET染色作为hET自氧化的阴性对照。
- 体内检测诱导毛发生长和烧伤愈合后背部皮肤中ROS的产生，然后进行光动力治疗
注意：此步骤使用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DHF-DA）进行，这是一种细胞通透性非荧光化合物，在细胞内酯酶切割后，与ROS特异性反应，产生2′，7′-二氯荧光素（DCF）荧光染料。- 使用为诱导毛发生长（第1.1节）或烧伤愈合（第1.2节）而准备的动物。在局部mALA乳膏治疗之前（见第2.1和2.2节），在所有靶标对照/治疗皮肤区域局部分配100μL 1mg / mL的50%乙醇DHF-DA，让皮肤充分吸收材料并继续进行局部mALA乳膏应用。
- 将处理过的动物在黑暗中孵育4小时，用PBS彻底洗去皮肤上的局部mALA霜，并在皮肤上分配第二剂100μL的DHF-DA溶液。为了确认麻醉深度，每10分钟监测一次动物，直到完全恢复。
- 将治疗过的动物在黑暗中孵育50分钟，使用LED灯麻醉并照射整个背部皮肤，通量范围为2.5至4 J /cm 2 的636nm红光。
- 照射后，立即使用体内成像系统评估皮肤中产生的ROS水平（材料表）。将滤光片盒设置为445−490 nm激发和515-575 nm发射，捕获高质量图像并进行进一步分析。
注意：在没有光动力处理的情况下使用组织样品的DHF-DA染色作为DHF-DA自氧化的阴性对照。
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Representative Results
在小鼠背部和尾部皮肤中局部施用mALA前体导致PpIX在整个组织中显着积累，并且显着地在毛囊中，如该化合物在蓝光（407nm）激发下的红粉红色荧光所证明的那样（图2A，C）。随后以2.5−4J / cm 2的通量用红光（636nm）照射处理的组织，促进组织中ROS的瞬时产生，特别是在毛囊的凸起区域（图2B，D）。
在小鼠皮肤体内开启非致命ROS产生可促进光处理两天后毛囊凸起区域中LRC的数量显着增加，这些LRC被归类为体细胞干细胞（图3，左图）。值得注意的是，LRC数量的增加是短暂的，在治疗后6天恢复到正常水平（图3，右图）。由于该区域是小鼠皮肤中主要的干细胞生态位之一，因此该区域细胞增殖的瞬时诱导主要反映了凸起生态位的功能激活以及增殖和分化的常驻干细胞程序22,23。
凸起毛囊壁龛的ROS依赖性激活进一步与皮肤的生理反应有关。因此，短暂的ROS产生显着加速了2度烧伤后的皮肤愈合过程（图4A，B）。对受损/结痂皮肤区域逐渐减少的量化证明了组织中 PpIX 依赖性瞬时 ROS 产生诱导的伤口愈合加速过程的稳健性和统计学意义（图 4C）。同样，非致命的ROS水平在第二次配位休止期剃须后强烈促进头发生长（图5A），在此期间毛囊难治性以响应生长刺激22,23，构成了评估新化合物和/或刺激头发生长过程潜力的适当方法。值得注意的是，使用抗坏血酸（AA）等抗氧化化合物导致显示毛发生长加速的动物数量在统计学上显着减少（图5B）。此外，光处理后皮肤中的ROS产生，通过皮肤中DHF的荧光发射来量化，抗氧化剂化合物也显着减少（图5C）。总之，这些结果表明，基于PpIX的光处理后ROS的产生是诱导组织中生理反应的严格要求。
图 1：使用血红素生物合成途径在细胞和组织中原位控制内源性光动力产生 ROS 的理论背景。（A）在光动力处理过程中导致分子氧激发的基本光化学反应的示意图。在吸收具有适当λ的光时，基态S0的光敏剂分子（PS）经历向激发态单线态S1的转变。由于任何激发态在能量上都不如基态可取，因此分子在短时间内返回S0。大多数PS在从S 1跃迁到三重态T1时具有很高的量子效率，通常其特征是寿命相对较长。处于激发三重态的活化PS可以通过两种不同的途径与其他分子反应。I型光化学反应是将电子转移到相邻分子以形成自由基物种;这些自由基可能与分子氧反应产生ROS，包括超氧阴离子（•O 2-），过氧化氢（H 2 O 2）和羟基自由基（•OH）。II型光化学反应是PDT中大多数PS的主要过程。在该反应过程中，能量（不是电子）向分子氧（基态中的配置是三重态，3O 2）的转移驱动非自由基但高活性单线态氧（1O2）的形成。在这些反应过程中形成的光产物会触发一连串生化事件，导致氧化应激，最终导致细胞死亡或可能刺激细胞生长。（B）5-氨基乙酰丙酸（ALA）是血红素生物合成途径中的天然前体，涉及线粒体和胞质细胞区室。ALA合酶活性由负反馈控制调节，其中游离血红素（该途径的最终产物）抑制甘氨酸和琥珀酰辅酶A合成ALA。外源性ALA或其衍生物氨基乙酰丙酸甲酯（mALA）的给药绕过调节反馈系统，因此下游代谢物，特别是原卟啉IX（PpIX）积聚在细胞中诱导光敏作用。铁插入PpIX中的催化剂酶铁螯合酶的限速特性促进了这种内源性PS化合物的积累。PBG = 胆色素原。这个数字是从卡拉斯科等人19修改的。请点击此处查看此图的大图。
图 2：用 mALA 和红光进行光动力处理可诱导皮肤中瞬时产生 ROS。 （A）背部皮肤mALA主题治疗后内源性PpIX的积累。同一动物的左侧用作对照。（B）左图：DHF-DA监测的依赖于PPIX的ROS（mALA+Light）生产。右图：背部皮肤相对ROS产生的时程分析;在照射后的不同时间量化每只动物中mALA+光区域的DHF-DA荧光发射与光区域的相对积分密度，并按照方法学中的描述进行归一化。表示 SE ±平均值（每个时间点的 n = 4）。（C）PpIX在尾部皮肤中的定位（荧光显微镜图像）。（D）hET显示mALA+光后尾部皮肤产生ROS显示毛囊凸起区域增加和持续积累。显示了代表性的共聚焦显微镜图像（最大投影）。比例尺 = 100 μm。这个数字是从卡拉斯科等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：在皮肤中开启原位 ROS 产生可促进毛囊壁龛凸起区域的干细胞显着增加。 左图：代表性共聚焦显微镜图像（最大投影），显示基于PpIX的光处理2天后，BrdU标签保留细胞（LRC）在小鼠尾部皮肤整体支架中的定位以及毛囊凸起区域中LRC的明显增加。右图：毛囊凸起区域LRC数量的量化。表示平均值 + SE （n = 4）。比例尺 = 50 μm。这个数字是从卡拉斯科等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：在皮肤中开启原位 ROS 产生可加速烧伤愈合。 （A）与对照样品相比，mALA在治疗动物烧伤区域诱导的PPIX产生。（B）mALA+光处理和对照动物的烧伤愈合进化。（C）烧伤区域的时间过程定量（左图）显示mALA+光处理动物的烧伤愈合加速;表示未愈合区域的平均值 + SE （n = 4）。曲线下面积分析（右图）显示了两条时程曲线之间的统计差异（p ≤ 0.06）。这个数字是从卡拉斯科等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：在皮肤中开启原位 ROS 生产可刺激头发生长。 （A）上行：与光对照区（左侧）相比，mALA+光（背部皮肤右侧）在难治期休止期诱导毛发生长。底行：抗坏血酸（AA）抗氧化治疗抑制了皮肤中的ROS产生和mALA + Light诱导的头发生长加速。（B）在没有或存在抗氧化剂AA的情况下，与对照区域相比，mALA-PT中显示毛发生长加速的动物百分比的量化（n = 4在3个独立实验中）。（C）量化mALA-PT期间AA诱导的背部皮肤ROS产生抑制（n = 4）。在所有情况下，条形表示均值 + 标准误差。这个数字是从卡拉斯科等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这里，我们提出了一种方法，该方法允许在小鼠皮肤中瞬时激活体内内源性ROS产生，并具有生理效应。该方法基于光动力程序，以诱导内源性光敏剂PpIX的受控和局部刺激（图1B）。这种实验方法是在体内实验系统中研究ROS生物学的有趣工具，与使用外部ROS源（通常是过氧化氢）的方法相比，该方法取得了重大进展，并允许在组织/样品中受控和局部产生ROS。
鉴于过量施用基于氨基乙酰丙酸酯的前体以促进PpIX在细胞内的积累，该方法的关键步骤是建立足够的光剂量以诱导组织中ROS水平的瞬时产生低于损伤阈值但显示出强烈的刺激作用。目前没有可用的技术可以直接量化细胞和组织中产生的任何类型的ROS的确切数量。在我们的方法中，仍然不可能在给定的光剂量，产生的ROS的确切量和给定的生物学效应（例如，细胞死亡或细胞增殖）之间建立直接相关性。出于这个原因，任何特定实验模型的光剂量（通量）应由研究人员使用每种情况选择的定性或半定性参数根据经验确定。在小鼠皮肤的情况下，我们选择细胞死亡和组织损伤之间的易于测量的过渡，以及诱导显着的瞬时增殖波。
这里介绍的方法已被证明在改善不同过程中的皮肤再生方面非常有效，包括烧伤愈合和毛囊生长。这些观察结果为该技术在临床中实施治疗应用铺平了道路，以治疗偶然或慢性烧伤和伤口或皮肤的不同病理，特别是涉及有缺陷的干细胞功能的毛囊。
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Disclosures
本作品中描述的程序的所有商业应用均受CSIC-UAM专利（EP2932967A1）的保护，该专利由EC，MIC和JE撰写，并授权给Derma Innovate SL进行商业开发。JE和JJM在Derma Innovate SL担任顾问职位。
Acknowledgments
这项工作得到了西班牙经济与竞争部（RTC-2014-2626-1至JE）和卡洛斯三世健康研究所（PI15/01458至JE）的资助。EC得到了Atracción de Talento Investigador拨款2017-T2 / BMD-5766（马德里市和UAM）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
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