Stimulering av stamcellsnischer och vävnadsregenerering i mushud genom omkopplingsbar protoporfyrin IX-beroende fotogenerering av reaktiva syreradikaler in situ

Summary

Syftet med detta protokoll är att inducera övergående in vivo-produktion av icke-dödliga nivåer av reaktiva syreradikaler (ROS) i mushud, vilket ytterligare främjar fysiologiska reaktioner i vävnaden.

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll för att inducera omkopplingsbar in vivo fotogenerering av endogena reaktiva syreradikaler (ROS) i mushud. Denna övergående produktion av ROS in situ aktiverar effektivt cellproliferation i stamcellsnischer och stimulerar vävnadsregenerering, vilket starkt manifesteras genom accelerationen av brännskadeläkning och hårfollikeltillväxtprocesser. Protokollet är baserat på en reglerbar fotodynamisk behandling som behandlar vävnaden med prekursorer av den endogena fotosensibiliseraren protoporfyrin IX och bestrålar vidare vävnaden med rött ljus under tätt kontrollerade fysikalisk-kemiska parametrar. Sammantaget utgör detta protokoll ett intressant experimentellt verktyg för att analysera ROS-biologi.

Introduction

Reaktiva syreradikaler (ROS) är resultatet av den kemiska reduktionen av molekylärt syre för att bilda vatten och inkluderar singlettsyre, superoxidanjon, väteperoxid och hydroxylradikalen ^1,2,3. ROS har en mycket kort livslängd på grund av deras extremt kemiska reaktiva natur. I aeroba organismer bildas ROS för övrigt inuti cellerna som en viktig läckande biprodukt av aerob andning (elektrontransportkedja) i mitokondrierna. Övergående ackumulering av höga nivåer av ROS i cellen resulterar i ett oxidativt stresstillstånd som kan framkalla irreversibel inaktivering av proteiner, lipider och sockerarter och införandet av mutationer i DNA-molekylen 2,3,4,5. Den gradvisa ackumuleringen av oxidativ skada i celler, vävnader och hela organismer ökar stadigt med tiden och har associerats med induktion av celldödsprogram, flera patologier och åldringsprocessen 2,3,4,6.

Aeroba organismer har stadigt utvecklat effektiva molekylära mekanismer för att hantera överskott av ROS-ackumulering i celler och vävnader. Dessa mekanismer innefattar medlemmar av proteinfamiljen superoxiddismutas (SOD), som katalyserar superoxidradikaldismutation till molekylärt syre och väteperoxid, liksom olika katalaser och peroxidaser som använder antioxidantpoolen (glutation, NADPH, peroxiredoxin, thioredoxin ^7,8) för att katalysera den efterföljande omvandlingen av väteperoxid till vatten och molekylärt syre.

Flera rapporter stöder dock ROS roll som nyckelkomponenter i molekylära kretsar som reglerar kritiska cellfunktioner, inklusive proliferation, differentiering och rörlighet ^2,3,4. Detta koncept stöds ytterligare av den initiala identifieringen och karakteriseringen av dedikerade ROS-producerande mekanismer i aeroba organismer, inklusive lipoxygenaser, cyklooxygenaser och NADPH-oxidaser ^9,10. I detta avseende uppvisar ROS en aktiv roll under embryoutveckling av ryggradsdjur 11,12,13 och nyckelroller för dessa molekyler i regleringen av specifika in vivo fysiologiska funktioner har rapporterats i olika experimentella system, inklusive differentieringsprogrammet för hematopoetiska förfäder i Drosophila^14, helande induktion i zebrafisk eller svansregenerering i Xenopus grodyngel ¹⁵. Hos däggdjur har ROS varit involverat i självförnyelse/differentieringspotentialen hos neurala stamceller i en neurosfärmodell¹⁶ och i avregleringen av tarmstamcellsfunktionen under kolorektal cancerinitiering¹⁷. I huden har ROS-signalering associerats med epidermal differentiering och reglering av hudens stamcellsnisch och hårsäckens tillväxtcykel^18,19.

I detta perspektiv är en viktig experimentell begränsning för att bestämma ROS fysiologiska roller i biologiska system, både under normala eller patologiska förhållanden, bristen på adekvata experimentella verktyg för att inducera kontrollerad produktion av dessa molekyler i celler och vävnader, som exakt liknar deras fysiologiska produktion som andra signalbudbärare. För närvarande innefattar de flesta experimentella tillvägagångssätt administrering av exogen ROS, mestadels i form av väteperoxid. Vi har nyligen implementerat ett experimentellt tillvägagångssätt för att slå på en övergående, icke-dödlig in vivo-produktion av endogen ROS i mushuden, baserat på administrering av prekursorer av den endogena fotosensibiliserande protoporfyrin IX (PpIX; t.ex. aminolaevulinsyra eller dess metylderivatmetylaminolevulinat) och ytterligare bestrålning av provet med rött ljus för att inducera in situ-bildning av ROS från intracellulärt molekylärt syre (figur 1). Denna fotodynamiska procedur kan effektivt användas för att stimulera inhemska stamcellsnischer, vilket aktiverar vävnadens regenerativa program^19,20 och öppnar vägen för nya terapeutiska modaliteter inom hudregenerativ medicin. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av protokollet, som visar representativa exempel på stimulering av stamcellsnischer, mätt som en ökning av antalet långsiktiga 5-brom-2′-deoxiuridin (BrdU) etiketthållande celler (LRC) i hårsäckens utbuktningsområde^19,21 och efterföljande aktivering av regenereringsprogram (acceleration av hårväxt och brännläkningsprocesser) inducerad av övergående^, icke-dödlig ROS-produktion i huden av C57Bl6-musstam.

Protocol

All mushållning och alla försöksförsök måste utföras i enlighet med lokal, nationell, internationell lagstiftning och riktlinjer för djurförsök. 1. Induktion av hårväxt, brännskadeinduktion och identifiering av långsiktiga BrdU LRC i svanshudepitelet OBS: Använd 10-dagars eller 7-veckors gamla C57BL / 6-möss, helst kullkamrater, för de experimentella mönster som beskrivs nedan. I alla experimentella procedurer kommer djuren att bedövas genom 3% isof…

Representative Results

Den topiska administreringen av mALA-prekursorn i musens rygg- och svanshud resulterar i en signifikant ackumulering av PpIX i hela vävnaden och märkbart i hårsäcken, vilket demonstreras av den rödrosa fluorescensen hos denna förening under excitation av blått ljus (407 nm) (figur 2A, C). Efterföljande bestrålning av behandlad vävnad med rött ljus (636 nm) vid en fluens av 2,5−4 J/cm2 främjar övergående produktion av ROS i vävnaden, särskilt i h?…

Discussion

Här presenterar vi en metodik som möjliggör en övergående aktivering av endogen ROS-produktion in vivo i mushud med fysiologiska effekter. Metoden är baserad på en fotodynamisk procedur för att inducera en kontrollerad och lokal stimulering av den endogena fotosensibiliseraren PpIX (figur 1B). Detta experimentella tillvägagångssätt är ett intressant verktyg för att studera ROS-biologi i in vivo-experimentella system som utgör ett betydande framsteg jämfört med metoder som anv…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA