Summary
यहां, हम चूहों में कोलोनोस्कोपिक-निर्देशित चुटकी बायोप्सी को प्रेरित करने और वास्तविक समय में घाव बंद करने को ट्रैक करने के लिए प्रक्रिया का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, घाव बिस्तर के हिस्टोलॉजिकल, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और आणविक विश्लेषण के लिए ऊतकों की तैयारी के तरीके प्रदान किए जाते हैं।
Abstract
तीव्र चोट प्रतिक्रिया के साथ-साथ घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान होने वाले ऊतक और सेलुलर परिवर्तनों को समझना गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ के रोगों का अध्ययन करते समय सर्वोपरि महत्व का है। मुरीन कोलोनिक पिंच बायोप्सी मॉडल इन प्रक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इसके अतिरिक्त, आंत चमकदार सामग्री (जैसे, रोगाणुओं) और पेट के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, घाव प्रेरण और विश्वसनीय तरीके से समय के साथ घाव बंद करने को ट्रैक करने की क्षमता चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा, ऊतक की तैयारी और अभिविन्यास को एक मानकीकृत तरीके से किया जाना चाहिए ताकि हिस्टोलॉजिक और आणविक परिवर्तनों से बेहतर ढंग से पूछताछ की जा सके। यहां, हम बायोप्सी-प्रेरित चोट और दोहराने कोलोनोस्कोपी के माध्यम से घाव बंद करने की निगरानी का वर्णन करने वाली एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं। एक दृष्टिकोण वर्णित है कि घाव के आकार के सुसंगत और प्रजनन माप सुनिश्चित करता है, आणविक विश्लेषण के लिए घाव बिस्तर इकट्ठा करने की क्षमता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतकों की धारा पर घाव बिस्तर कल्पना । इन तकनीकों को सफलतापूर्वक पूरा करने की क्षमता कोलन के भीतर तीव्र चोट प्रतिक्रिया, घाव भरने और चमकदार-मेजबान बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देती है।
Introduction
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ एक जटिल अंग प्रणाली है जो इसके कई कार्यों, मेजबान सेल प्रकार (जैसे एपिथेलियल, प्रतिरक्षा, स्ट्रोमल, आदि) के साथ-साथ खरबों रोगाणुओं को देखते हुए है। इस जटिलता के प्रकाश में, जीआई पथ की बीमारियों में अक्सर इन सभी कारकों का परस्पर क्रिया शामिल होता है। उदाहरण के लिए, भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) जीआई पथ में सूजन और छूट के चक्रों से जुड़े होते हैं, जिसमें भड़काऊ कोशिकाओं, डिस्बायोसिस और एपिथेलियल रिपेयर1,2,3,4,5,6, 7की सक्रियता शामिल होती है। रोग के रोगजनकों को स्पष्ट करने के लिए आईबीडी और जीआई पथ की अन्य भड़काऊ स्थितियों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मॉडल सिस्टम होना महत्वपूर्ण है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों और कृंतक8,9,10में डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) जैसे रसायनों के उपयोग सहित आईबीडी रोगजनकों का अध्ययन करनेकेलिए कई मॉडल मौजूद हैं। इन मॉडलों की सीमाओं में सूजन के प्रेरण को ठीक से नियंत्रित करने के साथ-साथ घाव भरने के मूल्यांकन में कठिनाइयों को ठीक से नियंत्रित करने में असमर्थता शामिल है। आईबीडी रोगजनकों के पहलुओं की नकल करने के लिए वैकल्पिक तरीके चिकित्सा के विकास के लिए उपयोगी साबित हो सकते हैं।
चूहों में कोलोनोस्कोपिक-निर्देशित चुटकी बायोप्सी भड़काऊ प्रतिक्रिया, घाव भरने, साथ ही पेट में मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली प्रदान करती है। इस दृष्टिकोण को पहली बार 2009 में एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जिसने आंत11में तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया और घाव भरने का अध्ययन करने के लिए अपनी उपयोगिता का प्रदर्शन किया था। बाद के अध्ययनों में इस तकनीक का उपयोग उपनिवेशीय घाव उपचार 11 ,12 , 13 , 14,15,16 , 17,18में विभिन्न सिग्नलिंग रास्तों के साथ -साथ आंत माइक्रोबायोटा की भूमिकाओं का मूल्यांकन करनेकेलिए किया गया । हाल ही में, हमारे समूह ने इस मॉडल का उपयोग उपनिवेश चोट19के तीव्र प्रतिक्रिया में स्पिफिंगोसाइन-1-फॉस्फेट सिग्नलिंग और बैक्टीरिया के महत्व की जांच करने के लिए किया। हालांकि उपयोगी, चूहों में कोलोनोस्कोपिक-निर्देशित चुटकी बायोप्सी बाहर ले जाने और बाद में ऊतक परिवर्तन का मूल्यांकन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, चोट के शामिल होने पर आंत्र का छिद्र हो सकता है और सीरियल कोलोनोस्कोपी के माध्यम से घाव बिस्तर के लगातार माप सुनिश्चित करना मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, हिस्टोलॉजिकल या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए घाव बिस्तर की कल्पना करने के लिए कोलोनिक ऊतक को ठीक से उन्मुख करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यद्यपि इन तरीकों18,20के बारे में कुछ जानकारी मौजूद है, इन तकनीकों का एक सटीक चरण-वार विवरण दृश्य एड्स इस मॉडल की विश्वसनीयता और व्यापक उपयोगिता को बढ़ाने का वादा करता है। यहां, हम चूहों में कोलोनोस्कोपिक-निर्देशित चुटकी बायोप्सी करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं, समय के साथ घाव बंद करने को ट्रैक करते हैं और घाव बिस्तर के हिस्टोलॉजिक और आणविक विश्लेषण को सक्षम करने के लिए ऊतक तैयार करते हैं। इन तकनीकों को पूरा करने के लिए एक मानक विधि बनाना इस मॉडल के उपयोग का विस्तार कर सकता है जो पहले से जांच किए गए मध्यस्थों का अध्ययन कर सकते हैं जो जीआई सूजन और घाव की मरम्मत के लिए संभावित रूप से महत्वपूर्ण हैं।
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Protocol
यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं को वेइल कॉर्नेल मेडिसिन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । करने के लिए: "यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और Weill कॉर्नेल मेडिसिन और पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय की उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. कोलोनोस्कोपी और घाव प्रेरण
- एंडोस्कोप के घटकों को पहले 1.9 मिमी कठोर बोर एंडोस्कोप को म्यान(चित्रा 1ए-बी)में डालकर पूर्व-इकट्ठा करें। काम चैनल(चित्रा 1C)के बगल में म्यान के बाईं ओर गैस वाल्व के लिए प्रदान की ट्यूबिंग का उपयोग कर हवा पंप (कोलोनिक इन्स्फलेशन प्रदान करने के लिए) संलग्न करें ।
नोट: हालांकि यहां वर्णित लेंस 0 डिग्री है, इस उद्देश्य के लिए 30 डिग्री लेंस का भी उपयोग किया जा सकता है। - सुनिश्चित करें कि काम करने वाले चैनल खुली स्थिति में है और काम करने वाले चैनल के माध्यम से 3 एफआर बायोप्सी संदंश डालें और इसे म्यान के अंत तक आगे बढ़ाते हैं (यह सुनिश्चित करते हुए कि यह म्यान से बाहर नहीं निकलता है)(चित्रा 1C)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रकाश स्रोत और वीडियो इमेजिंग डिवाइस के लिए इकट्ठे एंडोस्कोप संलग्न करें।
- एक इंडक्शन कक्ष में ऑक्सीजन के साथ 5% आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। फिर माउस को अपने वेंट्रल साइड पर एक हीटिंग सिस्टम (हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए) युक्त एंडोस्कोपिक मंच पर ले जाएं और ऑक्सीजन के साथ 2% आइसोफ्लुन के साथ नाक शंकु का उपयोग करके संज्ञाहरण के नीचे बनाए रखें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों में पशु चिकित्सक मरहम जोड़ें। सुनिश्चित करें कि माउस एक पलटा के लिए परीक्षण करने के लिए पीछे के पैर को धीरे से पिंच करके पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है।
नोट: चूहों के किसी भी तनाव या या तो सेक्स का उपयोग इस तकनीक के साथ किया जा सकता है; हालांकि, यह बेहतर है कि चूहों की उम्र कम से कम 8 सप्ताह है इसलिए वे प्रक्रिया के लिए काफी बड़े हैं।- संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों में पशु चिकित्सक मरहम जोड़ें।
- सुनिश्चित करें कि माउस एक पलटा के लिए परीक्षण करने के लिए पीछे के पैर को धीरे से पिंच करके पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है।
- कमरे के तापमान फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक संलग्न चूहे ग्वेज सुई के साथ एक 3 एमएल सिरिंज भरें। माउस के गुदा में सुई लगभग 1 सेमी डालें और धीरे-धीरे मल सामग्री को साफ करने के लिए पीबीएस को डालने दें। कई मल छर्रों को पीबीएस के साथ माउस से बाहर निकलना चाहिए जो संचार किया गया था।
नोट: पीबीएस की अत्यधिक मात्रा के इन्स्टिलेशन के परिणामस्वरूप ल्यूमेन में फोम गठन हो सकता है जो ल्यूमेन को देखने को अस्पष्ट कर सकता है। - माउस के गुदा में इकट्ठे एंडोस्कोप 0.5 सेमी डालें। बायोप्सी को मलाशय के ल्यूमेन में तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि संदंश के पूर्ण 'जबड़े' (काज सहित) म्यान के अंत से परे नहीं हैं (जैसा कि वीडियो मॉनिटर पर मनाया गया है)(पूरक वीडियो 1)। 90 डिग्री संदंश को चालू करें ताकि जबड़े पूर्व-पश्चिम अभिविन्यास(पूरक वीडियो 1) में खुलें।
- बायोप्सी के लिए, संदंश खोलें और लगभग 1 सेमी आगे बढ़ें, संदंश को बंद करें और एक चिकनी गति में उन्हें बंद करते समय जल्दी से संदंश पर वापस खींचें(पूरक वीडियो 1)।
- बायोप्सी करते समय कोलन को पूरी तरह से इनसफ्लैट करने से बचें। इसलिए, इस चरण के दौरान गैस वाल्व के दाईं ओर खुला छोड़ दें; हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संदंश खोलने पर म्यूकोसा को नुकसान पहुंचाने का खतरा होता है जब कोलन इस स्थिति में होता है।
2. घाव बिस्तर की कल्पना और मापने
- कोलोनोस्कोप रिकॉर्डिंग डिवाइस से जुड़े पैर पेडल दबाकर बायोप्सी के तुरंत बाद वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करें। पूरी तरह से गैस वाल्व के दाईं ओर के खिलाफ एक सूचकांक उंगली को मजबूती से दबाने के लिए पूरी तरह से खोलने को कवर करने के लिए एंडोस्कोप में हवा बल और इस तरह कोलन में ।
नोट: हालांकि यह प्रोटोकॉल एक एयर पंप के उपयोग का वर्णन करता है जिसमें हवा के प्रवाह को मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जाता है, नियंत्रित हवा की आपूर्ति के साथ एक पेरिस्टाल्टिक पंप का भी उपयोग किया जा सकता है। - बंद स्थिति(पूरक वीडियो 1)में, जबकि म्यान से बाहर वापस संदंश अग्रिम, और गुदा ल्यूमेन में) । घाव के तुरंत ऊपर गुदा की दीवार के खिलाफ संदंश रखें जब तक कि जबड़े का आधार देखने के क्षेत्र के शीर्ष किनारे(चित्रा 2 और पूरक वीडियो 1)के साथ गठबंधन न हो जाए। घाव का स्पष्ट दृश्य देखे जाने तक पेट को पूरी तरह से इनसफ्लैटिंग जारी रखें।
नोट: एंडोस्कोप और घाव(चित्रा 2,सफेद तीर) के लेंस के बीच लगातार दूरी सुनिश्चित करने के लिए जांच किए जा रहे प्रत्येक माउस के लिए आधार तक केवल संदंश के जबड़े को प्रकट करने के लिए पर्याप्त संदंश का विस्तार करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। - यदि एक ही दिन कई चूहों पर बायोप्सी करना है, तो पिछले माउस के बायोप्सी ऊतक को संदंश (प्रदान की गई सफाई ब्रश का उपयोग करके) से हटा दें और अगले माउस में घाव को उत्प्रेरित करने से पहले इसे साफ करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ लेंस म्यान को मिटा दें।
नोट: हालांकि इस प्रोटोकॉल में प्रति माउस एक बायोप्सी का वर्णन किया गया है, लेकिन एक माउस पर कई बायोप्सी की जा सकती है बशर्ते पूर्व बायोप्सी से लिए गए ऊतक को संदंश से हटा दिया जाए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि बाद की बायोप्सी पर पूर्ण बायोप्सी ली जा सकती है। - माउस को अन्य चूहों के पिंजरे शून्य में रखें और एक तौलिया के शीर्ष पर वायुमार्ग को स्पष्ट रखने के लिए जब तक कि यह प्रक्रिया को पूरा करने के बाद संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए। माउस की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह एनेस्थीसिया से ठीक हो जाए जैसा कि गतिविधि को फिर से प्राप्त करके संकेत दिया गया है।
नोट: दो लोगों को घाव को प्रेरित करने और 0 दिन पर घाव बिस्तर की कल्पना करने की आवश्यकता होती है (एक एंडोस्कोप का संचालन और दूसरा बायोप्सी संदंश का संचालन करता है) लेकिन बाद के दिनों में घावों की कल्पना करने के लिए केवल एक व्यक्ति की आवश्यकता होती है (जैसा कि नीचे वर्णित है)। - बाद के घाव माप (आमतौर पर बायोप्सी के बाद दिन 2, 4 और 6) के लिए माउस और कोलोनोस्कोपी की तैयारी के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें, जैसा कि घाव के प्रेरण को छोड़कर वर्ग 1.1-1.4 में ऊपर वर्णित है।
- एंडोस्कोप डालने के बाद इन समय बिंदुओं पर वीडियो मॉनिटर पर घाव बिस्तर का पता लगाएं, और बायोप्सी संदंश (बंद स्थिति में) को घाव बिस्तर के तुरंत ऊपर अग्रिम, पेट को इनसफ्लेट करें और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करें, जैसा कि सेक्शन 2.1 और 2.2(चित्रा 2)में वर्णित है।
नोट: बायोप्सी के बाद 6 दिनों से अधिक घाव बिस्तर का पता लगाना मुश्किल हो सकता है। - एंडोस्कोप के लेंस और दिनों में घाव के बीच एक सुसंगत दूरी सुनिश्चित करने के लिए दिन 0 पर के रूप में एक ही दूरी के लिए इन बाद के दिनों में ल्यूमेन में संदंश अग्रिम। लेंस और घाव के बीच एक सुसंगत दूरी सुनिश्चित करने से समय के साथ माप की सटीकता में वृद्धि होगी।
नोट: एक व्यक्ति इन दिनों माप ले सकता है (एंडोस्कोप दाएं हाथ से संचालित होता है और बायोप्सी संदंश बाएं हाथ से उन्नत होते हैं)। - एक बार सभी माप पूरा हो जाने के बाद, वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर में सीरियल कोलोनोस्कोपी की वीडियो रिकॉर्डिंग खोलें जो वीडियो से अभी भी शॉट्स बनाने में सक्षम बनाता है।
- वीडियो को एक फ्रेम में आगे बढ़ाया जाए जिसमें एक बिंदु दिखाया गया है जब घाव बिस्तर को आसानी से कल्पना की जा सकती है, बंद संदंश घाव बिस्तर के ऊपर और गुदा दीवार के खिलाफ होते हैं और दीवार तना हुआ होता है। इस फ्रेम का स्नैपशॉट लें और यह सुनिश्चित करने के लिए फ़ाइल नाम को कोड करें कि घाव बिस्तरों के माप अंधे तरीके से किए जाते हैं।
- घाव बिस्तर के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए NIH ImageJ में कोडित फ़ाइल नामों के साथ छवियों को खोलें। विश्लेषण टैब के तहत, सेट माप का चयन करें और क्षेत्र बॉक्स की जांच करें।
- मुख्य मेनू बार से फ्रीहैंड चयन उपकरण का चयन करें और घाव के चारों ओर एक परिधि बनाएं (चित्रा 2देखें)। विश्लेषण टैब के तहत उपाय का चयन करें और उस माप का मूल्य स्वचालित रूप से परिणाम विंडो में आबाद हो जाएगा।
- परिणाम विंडो के भीतर फ़ाइल टैब के नीचे सेव ए का चयन करके और स्प्रेडशीट फ़ाइल बनने के लिए एक्सटेंशन को बदलकर सभी छवियों के लिए माप पूरा करने के बाद परिणामों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
- घाव के प्रेरण के बाद के दिनों में घाव के आकार की गणना करें (यानी दिन 2, 4 और 6) एक स्प्रेडशीट में 0 दिन (घायल होने के तुरंत बाद) पर आकार के सापेक्ष। 0 दिन पर घाव के आकार से प्रत्येक दिन घाव के आकार को विभाजित करके और उस मूल्य को प्रतिशत में परिवर्तित करके इसे पूरा करें।
नोट: कोलोनोस्कोपिक देखने की इस विधि का उपयोग करके सामान्य परिस्थितियों में, घाव का सबसे बड़ा बंद पहले 2 दिनों (आकार में ~ 75% कमी) के बाद मनाया जाता है, जिसमें 4 और 6 दिनों में अधिक क्रमिक बंद होता है (क्रमशः ~ 80% और आकार में ~ 95% कमी)।
3. आणविक विश्लेषण के लिए घाव बिस्तर का संग्रह
- बायोप्सी के बाद चयनित दिन पर ग्रीवा अव्यवस्था (या समकक्ष तकनीक) के बाद सीओ2 श्वासावरोध का उपयोग करके इच्छामृत्यु माउस।
- शरीर की गुहा को बेनकाब करने के लिए त्वचा और पेट की मांसपेशियों को खोलकर पेट के डिस्टल क्षेत्र को फसल करें। कोलन के नीचे बंद कैंची रखें और इसे अंतर्निहित मेसेंट्री से छोड़ने के लिए धीरे-धीरे उठाएं और फिर कोलन को इसके मध्य बिंदु पर और गुदा में काटने के लिए इसे माउस से हटा दें।
- बर्फ-ठंड 1x PBS से भरा एक 20 मिलीएल सिरिंज से जुड़ी एक चूहा gavage सुई का उपयोग कर फ्लश मल सामग्री तो फिल्टर कागज पर पेट नीचे रखना ।
- कट फिल्टर पेपर पर कोलन देशांतर खोलें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मेसेन्टरिक पक्ष फिल्टर पेपर के खिलाफ नीचे का सामना कर रहा है। एक निचोड़ पिपेट का उपयोग करके म्यूकोसा में 0.2% मेथिलीन नीले रंग लागू करें जबकि ऊतक अभी भी फिल्टर पेपर पर है और फिर अतिरिक्त मेथिलीन नीले रंग को छान लें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे पेट देखें और घाव बिस्तर(चित्रा 3A)का पता लगाएं।
- 4 इंच माइक्रो आईरिस कैंची का उपयोग करना, घाव बिस्तर के किनारे के चारों ओर काटा(चित्रा 3A,धराशायी सर्कल) मांसपेशियों की परत में कटौती करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है (जब तक मांसपेशियों वांछित है) और टुकड़ा घाव बिस्तर एक ट्यूब के लिए तस्वीर ठंड या वांछित भंडारण विधि के लिए ठीक बिंदु चिमटी का उपयोग कर स्थानांतरित ।
नोट: इस तरीके से एकत्र ऊतक की मात्रा आरएनए-seq या समकक्ष विश्लेषण के लिए आरएनए निकालने के लिए पर्याप्त है ।
4. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए ऊतक की तैयारी
- माउस को इच्छामृत्यु दें और पेट को फसल करें जैसा कि चरण 3.1-3.2 में वर्णित है।
- कट फिल्टर पेपर पर कोलन देशांतर खोलें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मेसेन्टरिक पक्ष फिल्टर पेपर के खिलाफ नीचे का सामना कर रहा है। निचोड़ पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (या पसंद का फिक्सेटिव) लागू करें और पैराफिल्म के साथ ऊतक को कवर करें। 4-6 घंटे के लिए एक सीलबंद कंटेनर में फ्लैट छोड़ दें।
- भंडारण के लिए ऊतकों को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें। ऊतकों को संसाधित करने के लिए तैयार होने पर, पैराफिल्म को हटा दें और निचोड़ पिपेट का उपयोग करके म्यूकोसा में 0.2% मेथिलीन नीले रंग को लागू करें जबकि ऊतक अभी भी फिल्टर पेपर पर है। फिर अतिरिक्त मेथिलीन नीले रंग से छान लें।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे पेट देखें और घाव बिस्तर(चित्रा 3A)का पता लगाएं। एक #10 ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करना, घाव बिस्तर के केंद्र के माध्यम से सीधे काट दें और कोलन के शेष के माध्यम से एक सीधी रेखा में काटना जारी रखें, जैसे कि कोलन को आधे, लंबाई के लिहाज से(चित्रा 3 ए,काली रेखा) में काटा गया है।
- कोलन को प्रोसेस करें और फिर पैराफिन एम्बेड (या तो एक या दोनों पक्ष जो काटने के बाद रहते हैं) इस तरह कि स्केलपेल द्वारा काटा गया पक्ष (पक्ष जो बाइसेक्शन से पहले घाव बिस्तर का केंद्र था) पैराफिन में नीचे का सामना करना पड़ता है। वर्गों को काटने और वांछित दाग (ओं) या निर्माता (ओं) के लिए धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।
- यदि किसी दिए गए धुंधला के लिए क्रायोसेक्शन की आवश्यकता होती है, तो कोलन को चरण 3.1 में वर्णित करें और फिल्टर पेपर पर देशांतर खोलें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मेसेंटेरिक पक्ष फिल्टर पेपर के खिलाफ नीचे का सामना कर रहा है।
- हौसले से काटा कोलन के भीतर घाव बिस्तर Bisect के रूप में कदम ४.५ में वर्णित है और पेट एंबेड (या तो एक या दोनों पक्षों है कि काटने के बाद रहते हैं) इस तरह है कि पक्ष है कि स्केलपेल द्वारा काटा गया था एक आधार मोल्ड में नीचे चेहरा है आधा ऊतक ठंड माध्यम से भरा ।
- ठीक चिमटी के साथ जगह में ऊतक सुरक्षित और ठंड माध्यम कठोर करने के लिए सूखी बर्फ के शीर्ष पर एक धातु की थाली पर आधार मोल्ड जगह है । एक बार माध्यम के नीचे भाग जमे हुए है (और ऊतक जगह में आयोजित किया जाता है), ऊतक जारी करने और ठंड माध्यम के साथ आधार मोल्ड की शेष मात्रा को भरने और सूखी बर्फ पर वापस जगह है ।
- फ्रीजिंग माध्यम की पूरी मात्रा जम जाने के बाद, सेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
- पैराफिन या जमे हुए वर्गों के लिए, एच एंड ई द्वारा अतिरिक्त वर्गों को काटा और दाग दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि घाव बिस्तर को अध्ययन-विशिष्ट धुंधला करने के लिए आगे बढ़ने से पहले अनुभाग पर कब्जा कर लिया गया है। चित्रा 3B एक खंड का एक उदाहरण दिखाता है जिसमें घाव बिस्तर को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है।
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Representative Results
बायोप्सी करने के लिए आवश्यक छोटे आइटम (लेंस, म्यान, बायोप्सी संदंश) इन घटकों की उचित असेंबली के संकेतकों के साथ चित्रा 1 में दिखाए जाते हैं। चित्रा 2 घाव बिस्तर के स्वीकार्य विचारों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है ताकि घाव बिस्तर के आकार और घाव की बंद करने की दर को सही ढंग से निर्धारित किया जा सके। घाव बिस्तर के एक पूर्व वीवो दृश्य का एक उदाहरण चित्र 3ए में दिखाया गया है जिसमें घाव बिस्तर की परिधि के संकेतक शामिल हैं (आणविक विश्लेषण के लिए उत्पाद शुल्क के लिए क्षेत्र का संकेत) और जहां ऊतक को काटने के लिए अनुभागिंग पर घाव बिस्तर के दृश्य को सक्षम करने के लिए। चित्रा 3B एक एच एंड ई-दाग अनुभाग की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है जिसमें घाव बिस्तर को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। पूरक वीडियो 1 माउस के पेट के अंदर से बायोप्सी प्रक्रिया का एक दृश्य प्रदान करता है।
चित्रा 1: बायोप्सी करने के लिए आवश्यक आइटम। (A)लेंस की छवि (ए), म्यान (ख) और बायोप्सी फोर्सप्स (सी) । (ख)म्यान में लेंस का सम्मिलन । (ग)म्यान (ठोस तीर) के कार्य चैनल के माध्यम से संदंश का सम्मिलन । धराशायी तीर वायु पंप के लगाव के लिए सही स्थान इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: बायोप्सी के बाद घाव बिस्तर की कोलोनोस्कोपिक छवियां। अभी भी छवियों को बायोप्सी (दिन 0) और 2, 4, और 6 दिनों के बाद तुरंत कोलोनोस्कोपी की वीडियो रिकॉर्डिंग से बनाया गया था । नीली रेखाएं हर समय बिंदु पर घाव बिस्तरों के किनारों को इंगित करती हैं। तीर समय के साथ घाव बिस्तर के लगातार माप सुनिश्चित करने के लिए लेंस से गुदा की दीवार तक उचित दूरी सुनिश्चित करने के लिए ल्यूमेन में संदंश के विस्तार की सही लंबाई को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: घाव बिस्तर के पूर्व वीवो और अनुभागित छवियां। (क)बायोप्सी के बाद 2 दिन माउस से एक कोलन काटा गया था, जिसमें 0.2% मेथिलीन नीले रंग के साथ दाग दिया गया था और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे चित्रित किया गया था। धराशायी सर्कल घाव बिस्तर के किनारों को इंगित करता है। काली रेखा खंड के लिए एम्बेड करने से पहले घाव बिस्तर/पेट को विभाजित करने के लिए उचित स्थान को इंगित करती है । (ख)घाव बिस्तर के एच एंड ई-दाग अनुभाग की प्रतिनिधि छवि। तारक घाव बिस्तर का संकेत देते हैं और तीर घायल क्षेत्र की सीमाओं का संकेत देते हुए घाव बिस्तर के निकट बरकरार तहखाने का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक वीडियो 1: बायोप्सी प्रक्रिया और घाव बिस्तर इमेजिंग। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस मॉडल में घाव बंद करने की दर का प्रभावी ढंग से मूल्यांकन करने का प्रयास करते समय लगातार और सटीक बायोप्सी के साथ-साथ घाव के आकार के माप को सुनिश्चित करना सर्वोपरि महत्व का है। इसलिए, इस बात को लेकर कई उपाय किए जाने चाहिए कि प्रक्रियाओं को सही ढंग से अंजाम दिया जा रहा है । सबसे पहले, बायोप्सी की गहराई बहुत उथली या गहरी नहीं होनी चाहिए। यदि बहुत उथला है, तो घाव बंद करने का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त खिड़की नहीं होगी। चित्रा 2 0 दिन पर एक इष्टतम बायोप्सी गहराई और आकार को दर्शाता है। घाव बिस्तर के आसपास म्यूकोसा और घाव बिस्तर के नीचे बने ऊतक(चित्रा 2)के बीच स्पष्ट अंतर पर ध्यान दें। यदि बायोप्सी बहुत गहरी है, तो छिद्र इस प्रकार हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप एक अमूल्य माउस हो सकता है। 0 दिन पर बायोप्सी के बाद इन्सफ्लेशन पर, यदि माउस का पेट गंभीर रूप से डिफरेंट हो जाता है, तो छिद्र हुआ है और माउस का उपयोग मूल्यांकन के लिए नहीं किया जा सकता है और इसे इच्छामृत्यु दिया जाना चाहिए। यह उपयोगी है अगर एक ही व्यक्ति को आगे स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एक दिए गए अध्ययन के लिए बायोप्सी किया जाता है । दूसरा, मलाशय में बायोप्सी को पूरा करना महत्वपूर्ण है न कि अधिक समीपस्थ क्षेत्र में । यह देखते हुए कि मलाशय पेट के अधिक समीपस्थ क्षेत्रों की तुलना में मोटा है, छिद्र की एक स्पष्ट रूप से कम संभावना है। अंत से म्यान 0.5 सेमी के बाहर एक निशान बनाया जाना चाहिए और एंडोस्कोप केवल उस बिंदु तक डाला जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि बायोप्सी संदंश मलाशय से परे नहीं होगा। तीसरा, बायोप्सी के दौरान और घाव बिस्तर की कल्पना करने के लिए दोनों में फलती की सही मात्रा होना आवश्यक है। बायोप्सी के दौरान, यदि कोलन को भी डिस्टर्ब किया जाता है तो कोलोनिक दीवार बहुत तना हो जाएगी और बायोप्सी के लिए म्यूकोसा की पर्याप्त मात्रा नहीं होगी। इसलिए, यह सुझाव दिया जाता है कि एंडोस्कोप का संचालन करने वाला व्यक्ति गैस वाल्व के खुले अंत के खिलाफ अपनी इंडेक्स फिंगर को दबाएं नहीं, ताकि कोलन में न्यूनतम हवा के प्रवाह की अनुमति दी जा सके। हालांकि, घाव के आकार को मापने के प्रयोजनों के लिए घाव बिस्तरों की कल्पना करते समय विपरीत दृष्टिकोण का उपयोग किया जाना चाहिए। एक बार घाव स्थित होने के बाद, गैस वाल्व के खुले छोर के खिलाफ इंडेक्स फिंगर को मजबूती से दबाकर कोलन को पूरी तरह से इनसफ्लेट करें और वांछित दृश्य प्राप्त होने तक इसे वहां पकड़ें। इस उद्देश्य के लिए उपनिवेश की दीवार यथासंभव तना हुआ होना चाहिए। ध्यान दें, घाव बिस्तर के लगातार पार्श्व विचारों को सुनिश्चित करने के लिए कोलन का पूर्ण इनस्फोलेशन भी महत्वपूर्ण है। अंत में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लेंस और घाव के बीच एक सुसंगत दूरी बनाए रखी जाती है ताकि एक ही चूहों में कई कोलोनोस्कोपी पर सटीक माप सक्षम हो सके। एक करीब दूरी कृत्रिम रूप से घाव बिस्तर से बड़ा दिखाई देगा और एक दूर की दूरी यह छोटे दिखाई देगा । इसलिए, दूरी बनाए रखने के लिए एक गाइड के रूप में बायोप्सी संदंश का उपयोग करना बहुत उपयोगी है।
इस मॉडल का उपयोग करते समय ध्यान में रखने के लिए प्रमुख विचारों के अलावा, इस प्रक्रिया को प्रभावी ढंग से करने की क्षमता को भी प्रभावित करने के लिए अधिक मामूली बिंदु हैं। उदाहरण के लिए, यह निश्चित किया जाना चाहिए कि कोलोनोस्कोपी करते समय उपनिवेशीय ल्यूमेन स्पष्ट होता है। हालांकि फीकल सामग्री को पीबीएस के साथ फ्लश करके मंजूरी दी जाती है, लेकिन एंडोस्कोप डालने के बाद अतिरिक्त सामग्री मलाशय में उतर सकती है। इसके अलावा, बायोप्सी के तुरंत बाद घाव बिस्तर की कल्पना करते समय, रक्त क्षेत्र को अस्पष्ट कर सकता है। इसलिए, कभी-कभी मलाशय से एंडोस्कोप को हटाना आवश्यक होता है, ल्यूमिनल रक्त को साफ करने के लिए पीबीएस के साथ पेट को फ्लश करना और घाव बिस्तर की कल्पना करने के लिए एंडोस्कोप को फिर से स्थापित करना आवश्यक होता है। कुछ मामलों में, रक्त और अन्य चमकदार सामग्री लेंस का पालन हो सकती है, जो क्षेत्र को अस्पष्ट कर सकती है। इन मामलों में, एंडोस्कोप को माउस से हटा दिया जाना चाहिए और इमेजिंग जारी रखने से पहले ब्रश का उपयोग करके लेंस को मिटा दिया जाना चाहिए।
कोलोनोस्कोपिक निर्देशित चुटकी बायोप्सी मॉडल के आगमन से पहले, शोधकर्ताओं ने कोलोनिक घाव भरने की जांच करने के लिए सीमित मॉडल सिस्टम था । एक दृष्टिकोण यह था कि डीएसएस8जैसे उपनिवेशीय चोट के रासायनिक प्रेरकों के संपर्क से वसूली का मूल्यांकन किया जा सके । हालांकि, यह दृष्टिकोण चोट की सीमा को प्रेरित करने की सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति नहीं देता है और न ही पेट भर में चोट का स्थान। इसके अलावा, वास्तविक समय में म्यूकोसल हीलिंग के सटीक माप इन रासायनिक मॉडलों के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। हालांकि उपयोगी, बायोप्सी मॉडल की भी सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, ऑपरेटरों को डिस्टल पेट में घायल करने के लिए सीमित हैं । यह सीमा छोटे आंतों के अल्सर, एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दे के अध्ययन को रोकती है। इसके अतिरिक्त, हालांकि यह तकनीक आईबीडी रोगजनन के कुछ पहलुओं को पुनः रीकैपिटेट करती है, लेकिन इसे इस बीमारी का एक सच्चा मॉडल नहीं माना जा सकता है। तकनीकी विचार के, चूहों में लगातार घाव आकार को प्रेरित करना, अमूल्य घाव उत्पन्न करना, या घाव भरने की प्रक्रिया के बाद के चरणों में घाव बिस्तरों का पता लगाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इन बिंदुओं को ध्यान में रखते समय, अमूल्य नमूनों के नुकसान के लिए अतिरिक्त चूहों के साथ अध्ययन शुरू करने की सलाह दी जाती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को क्रोन और कोलाइटिस फाउंडेशन (डी.C.M) और न्यूयॉर्क क्रोन के फाउंडेशन (डी.C.M और ए.जे.डी. के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।) लेखक इस लेख के लिए वीडियो संगत बनाने के साथ सहायता के लिए सुश्री कारमेन फेरारा का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
