レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法
Summary
プラスミドDNAからの組換えロタウイルスの生成は、ロタウイルス複製および病因の研究、およびロタウイルス発現ベクターおよびワクチンの開発に不可欠なツールを提供する。本明細書において、蛍光レポータータンパク質を発現する株を含む組換えロタウイルスを生成するための簡略な逆遺伝学アプローチについて述べる。
Abstract
ロタウイルスは、ヒトを含む多くの哺乳類および鳥類宿主種の若者に重度の胃腸炎を引き起こすセグメント化された二本鎖RNAウイルスの大規模で進化する集団である。近年のロタウイルス逆遺伝学システムの登場により、指向性変異誘発を用いてロタウイルス生物学を探索し、既存のロタウイルスワクチンを修飾・最適化し、ロタウイルス多標的ワクチンベクターを開発することが可能になりました。本報告では、組換えロタウイルスの効率的かつ確実な回復を可能にする、簡素な逆遺伝学システムについて述べる。このシステムは、フルレングスロタウイルス(+)RNAを発現するT7転写ベクターと、T7 RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を構成的に産生するBHK細胞にRNAキャッピング酵素をコードするCMVベクターの共同トランスフェクションに基づいている。組換えロタウイルスは、トランスフェクトされたBHK-T7細胞をMA104細胞(ウイルス増殖に対して非常に寛容であるサル腎臓細胞株)で過剰播種することによって増幅される。本報告では、ゲノムセグメント7(NSP3)への2A翻訳ストップリスタート素子の導入を通じて、別の蛍光レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを生成するアプローチについても述べる。このアプローチは、ウイルスのオープンリーディングフレームのいずれかを削除または変更することを避け、蛍光タンパク質を発現させながら完全に機能するウイルスタンパク質を保持する組換えロタウイルスの産生を可能にする。
Introduction
ロタウイルスは、乳幼児の重度の胃腸炎の主な原因であり、他の多くの哺乳類および鳥類の若者1.レオビリダ科の一員として、ロタウイルスはセグメント化された二本鎖RNA(dsRNA)ゲノムを有する。ゲノムセグメントは、タンパク質2の3つの同心層から形成された非エンベロープ二面体のビリオン内に含まれている。ゲノムセグメントのシーケンシングと系統解析に基づいて、9種のロタウイルス(A-D、F-J)が定義されている。ロタウイルス種Aを含む株は、ヒト疾患4の大多数を担っている。過去10年間に始まった小児予防接種プログラムへのロタウイルスワクチンの導入は、ロタウイルスの死亡率および罹患率の有意な減少と相関している。最も顕著なのは、ロタウイルス関連の小児死亡率は、2000年の約528,000人から2016年には128,500人に減少した。,5ロタウイルスワクチンは、生きたウイルスの弱化株から処方され、生後6ヶ月までに小児に2〜3回投与される。ヒトおよび他の哺乳類種で循環する多数の遺伝的に多様なロタウイルス株は、突然変異および再分類を通じて急速に進化する能力と相まって、小児66、7、87,8に感染するロタウイルスの種類の抗原性変化を招く可能性がある。このような変化は、既存のワクチンの有効性を損ない、その交換または改変を必要とする可能性がある。
11個のロタウイルスゲノムセグメントの操作を可能にする完全プラスミドベースの逆遺伝学系の開発は、最近になってようやく達成された。これらのシステムの利用により、ロタウイルス複製および病因の分子詳細を解明し、抗ロタウイルス化合物の高スループットスクリーニング方法を開発し、ロタウイルスワクチンの新しい潜在的に効果的なクラスを作成することが可能になりました。ロタウイルス複製の間、制限されたウイルス(+)RNAは、ウイルスタンパク質の合成を導くだけでなく、子孫のdsRNAゲノムセグメント10、11,11の合成のためのテンプレートとしても役立つ。これまでに記載されたすべてのロタウイルス逆遺伝学系は、組換えウイルス9、12、13,の回収に使用されるcDNA由来(+)RNAの供給源として、T7転写ベクターを哺乳動物細胞株に9,トランスフェクションすることに依存している。13転写ベクター内では、フルレングスのウイルスcRNAは、ウイルス(+)RNAが本物の5’および3’末語を含むT7 RNAポリメラーゼによって合成されるような上流T7プロモーターと下流型肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムの間に位置付けられている(図1A)。第1世代逆遺伝学系では、T7RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を11T7(pT7)転写ベクターで発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞をトランスフェクトすることにより組換えウイルスが作られた、 各各々は、シミアンSA11ウイルス株のユニークな(+)RNAの合成、及び3つのCMVプロモーター駆動発現プラスミド、1つはワクシニアウイルスD1R-D12Lキャッピング酵素複合体9のアビアンレオウイルスp10FAST融合タンパク質および2つのコード化サブユニットをコードする。トランスフェクトされたBHK-T7細胞で生成された組換えSA11ウイルスは、MA104細胞とのオーバーシードにより増幅され、ロタウイルス増殖に対する細胞株透過性である。第1世代リバース遺伝学系の改変版は、もはや支持プラスミド12を使用していないと述べてきた。代わりに、改変系は、11個のSA11 T7転写ベクターを用いてBHK-T7細胞をトランスフェクトするだけで組み換えロタウイルスを生成することに成功し、ウイルス工場(viroplasm)ビルディングブロック(非構造タンパク質NSP2およびNSP5)のベクターが他のベクターよりも3倍高いレベルで追加されるという14,警告がある。逆遺伝学システムの改変バージョンは、ロタウイルス16、17,17のヒトKUおよびオデリア株の回復をサポートするも開発されている。ロタウイルスゲノムは、逆遺伝学による操作に非常に適しており、VP418、NSP19、NSP219、NSP3,20、21、およびNSP520,2122、23に導入された変異を伴ってこれまでに生成された組換えウイルスを有する。23これまでに生成された最も有用なウイルスの中には、蛍光レポータータンパク質(F)9、12、21、24、2512,21,24,25を発現するように設計されたものがある。9
本稿では、我々の研究室で使用する逆遺伝学システムのプロトコルを提供し、SA11ロタウイルスの組換え株を生成する。我々のプロトコルの主な特徴は、BHK-T7細胞を11 pT7転写ベクター(pT7/NSP2SA11およびpT7/NSP5SA11ベクターの3倍のレベルを含むように改変した)およびアフリカの豚熱ウイルス(ASFV)NP868Rキャッピング酵素をコードするCMV発現ベクターである21(我々の手では、NP868Rプラスミドの存在は、トランスフェクトされたBHK-T7細胞による組換えウイルスのより高い強化剤の産生をもたらす。本稿では、セグメント7タンパク質産物NSP3だけでなく、別のFPを発現する組換えウイルスを生成できるよう、pT7/NSP3SA11プラスミドを改変するためのプロトコルも提供する。これは、pT7/NSP3SA11プラスミドのNSP3オープンリーディングフレーム(ORF)を再設計し、下流の2Aトランスレーショナルストップリスタート要素を含み、続いてFP ORF(図1B)24、26を含むことによって達成される。24このアプローチを通じて、UnaG(緑)、mKate(ファーレッド)、mRuby(赤)、タグBFP(青)、CFP(シアン)、YFP(黄色)24、27、28,27など、さまざまなFPを発現する組み換えロタウイルスを28生成しました。これらのFP発現ロタウイルスは、NSP3 ORFを削除することなく作られ、機能するウイルスタンパク質の完全な補完をコードすると予想されるウイルスを生み出す。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々の研究室では、組換えSA11ロタウイルスを産生するために本明細書に記載されている逆遺伝学プロトコルに日常的に依存しています。このアプローチでは、分子生物学の技術やロタウイルスの研究経験がほとんどない人は、最初の試みでも組み換えウイルスを回復します。このプロトコルに従って、外来タンパク質(例えば、FP)を発現するように再設計され、配列の追加、欠失、点突然変?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金R03 AI131072とR21 AI144881、インディアナ大学スタートアップ資金、ローレンスM.ブラット基金によってサポートされました。私たちは、IUロタフージャー研究所、ウルリッヒ・デッセルベルガー、グイド・パパのメンバーに、逆遺伝学プロトコルの開発における多くの貢献と提案に感謝します。
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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