Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken
Summary
Die Generierung rekombinanter Rotaviren aus Plasmid-DNA ist ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Rotavirus-Replikation und Pathogenese sowie für die Entwicklung von Rotavirus-Expressionsvektoren und Impfstoffen. Hierin beschreiben wir einen vereinfachten Reverse-Genetik-Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, einschließlich Stämmen, die fluoreszierende Reporterproteine exdrücken.
Abstract
Rotaviren sind eine große und sich entwickelnde Population segmentierter doppelsträngiger RNA-Viren, die bei vielen Säugetier- und Vogelwirtarten, einschließlich des Menschen, eine schwere Gastroenteritis verursachen. Mit dem jüngsten Aufkommen von Rotavirus-Reverse-Genetik-Systemen ist es möglich geworden, gezielte Mutagenese zu verwenden, um die Rotavirusbiologie zu erforschen, bestehende Rotavirus-Impfstoffe zu modifizieren und zu optimieren und Rotavirus-Multitarget-Impfstoffvektoren zu entwickeln. In diesem Bericht beschreiben wir ein vereinfachtes Reverse-Genetik-System, das die effiziente und zuverlässige Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren ermöglicht. Das System basiert auf der Kotransfektion von T7-Transkriptionsvektoren, die Rotavirus (+)RNAs exdrücken, und einem CMV-Vektor, der ein RNA-Verschlussenzym in BHK-Zellen kodiert, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) produzieren. Rekombinante Rotaviren werden verstärkt, indem die transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen übersaat werden, einer Affen-Nierenzelllinie, die für das Viruswachstum sehr freizügig ist. In diesem Bericht beschreiben wir auch einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, die durch die Einführung eines 2A-Translational Stop-Restart-Elements in das Genomsegment 7 (NSP3) ein separates fluoreszierendes Reporterprotein ausdrücken. Dieser Ansatz vermeidet das Löschen oder Ändern eines der viralen offenen Leserahmen und ermöglicht so die Produktion rekombinanter Rotaviren, die voll funktionsfähige virale Proteine behalten und gleichzeitig ein fluoreszierendes Protein exezieren.
Introduction
Rotaviren sind Hauptursachen für schwere Gastroenteritis bei Säuglingen und Kleinkindern, sowie bei vielen anderen Säugetier- und Vogelarten1. Als Mitglieder der Reoviridae-Familie haben Rotaviren ein segmentiertes doppelsträngiges RNA-Genom (dsRNA). Die Genomsegmente sind in einem nicht umhüllten ikosaedralen Virion enthalten, das aus drei konzentrischen Schichten des Proteins2gebildet wird. Basierend auf der Sequenzierung und phylogenetischen Analyse der Genomsegmente wurden neun Arten von Rotavirus (A-D, F-J) definiert3. Die Stämme, die Rotavirus-Arten A umfassen, sind für die überwiegende Mehrheit der menschlichen Krankheit verantwortlich4. Die Einführung von Rotavirus-Impfstoffen in Impfprogramme für Kinder, die in den letzten zehn Jahren begonnen haben, korreliert mit einer signifikanten Verringerung der Sterblichkeit und Morbidität von Rotavirus. Vor allem ist die Zahl der Rotavirus-assoziierten Todesfälle im Kindesalter von etwa 528.000 im Jahr 2000 auf 128.500 im Jahr 2016gesunken 4,5. Rotavirus-Impfstoffe werden aus lebenden abgeschwächten Stämmen des Virus formuliert, wobei 2 bis 3 Dosen kindern im Alter von 6 Monaten verabreicht werden. Die große Anzahl genetisch unterschiedlicher Rotavirusstämme, die bei Menschen und anderen Säugetierarten zirkulieren, in Verbindung mit ihrer Fähigkeit, sich durch Mutagenese und Neusortierung schnell zu entwickeln, können zu antigenen Veränderungen in den Arten von Rotaviren führen, die Kinder6,7,8infizieren. Solche Änderungen können die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe untergraben, die deren Ersatz oder Änderung erfordern.
Die Entwicklung vollständig plasmidbasierter Reverse-Genetik-Systeme, die die Manipulation eines der 11 Rotavirus-Genomsegmente ermöglichen, wurde erst vor kurzem erreicht9. Mit der Verfügbarkeit dieser Systeme ist es möglich geworden, molekulare Details der Rotavirusreplikation und Pathogenese zu entwirren, verbesserte Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Anti-Rotavirus-Verbindungen zu entwickeln und neue potenziell effektivere Klassen von Rotavirus-Impfstoffen zu schaffen. Während der Rotavirus-Replikation leiten gekappte virale (+)RNAs nicht nur die Synthese viraler Proteine, sondern dienen auch als Vorlagen für die Synthese von Nachkommen dsRNA-Genomsegmenten10,11. Alle bisher beschriebenen Rotavirus-Reverse-Genetik-Systeme stützen sich auf die Transfektion von T7-Transkriptionsvektoren in Säugetierzelllinien als Quelle von cDNA-abgeleiteten (+)RNAs, die bei der Wiederherstellung rekombinanter Viren9,12,13verwendet werden. Innerhalb der Transkriptionsvektoren werden virale cDNAs in voller Länge zwischen einem vorgelagerten T7-Promotor und einem nachgeschalteten Hepatitis-Delta-Virus (HDV)-Ribozym positioniert, so dass virale (+)RNAs durch T7-RNA-Polymerase synthetisiert werden, die authentische 5′ und 3′-termini enthalten (Abbildung 1A). Im Reverse-Genetik-System der ersten Generation wurden rekombinante Viren durch Transfizierung von Babyhamster-Nierenzellen hergestellt, die T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) mit 11 T7 (pT7) Transkriptionsvektoren exdrücken, jede direkte Synthese einer einzigartigen (+)RNA des simians SA11-Virusstamms und drei CMV-Promotor-Antriebsexpressionsplasmiden, eines kodiert das Aviäre Reovirus p10FAST-Fusionsprotein und zwei kodierende Untereinheiten des Impfvirus D1R-D12L-Verschluss-Enzymkomplexes9. Rekombinante SA11-Viren, die in transfizierten BHK-T7-Zellen erzeugt wurden, wurden durch Übersaat mit MA104-Zellen verstärkt, einer Zelllinie, die für das Wachstum des Rotavirus freiist. Es wurde eine modifizierte Version des Reverse-Genetik-Systems der ersten Generation beschrieben, die keine Unterstützungplasmide mehr verwendet12. Stattdessen erzeugt das modifizierte System erfolgreich rekombinante Rotaviren, indem es BHK-T7-Zellen mit den 11 SA11 T7 Transkriptionsvektoren transfiziert, wobei der Vorbehalt besteht, dass Vektoren für die Bausteine der viralen Fabrik (Viroplasma) (nichtstrukturelle Proteine NSP2 und NSP5) auf Ebenen hinzugefügt werden, die 3-fach höher sind als die anderen Vektoren14,15. Modifizierte Versionen des Reverse-Genetik-Systems wurden auch entwickelt, die die Wiederherstellung der menschlichen KU- und Odelia-Stämme des Rotavirus16,17unterstützen. Das Rotavirus-Genom ist bemerkenswert anfällig für Manipulationen durch umgekehrte Genetik, mit rekombinanten Viren, die bisher mit Mutationen in VP418,NSP19, NSP219, NSP320,21und NSP522,23eingeführt wurden. Zu den nützlichsten Viren, die bisher erzeugt wurden, gehören diejenigen, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Reporterproteine (FPs)auszudrücken 9,12,21,24,25.
In dieser Publikation stellen wir das Protokoll für das Reverse-Genetik-System zur Verfügung, das wir in unserem Labor verwenden, um rekombinante Stämme von SA11-Rotavirus zu erzeugen. Das Hauptmerkmal unseres Protokolls ist die Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit den 11 pT7 Transkriptionsvektoren (modifiziert um 3x Ebenen des pT7/NSP2SA11 und pT7/NSP5SA11-Vektors) und eines CMV-Expressionsvektors, der das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) NP868R-Verschlussenzym21 (Abbildung 2) kodiert. In unseren Händen führt das Vorhandensein des NP868R-Plasmids zur Produktion von höheren Tittern rekombinanter Viren durch transfizierte BHK-T7-Zellen. In dieser Publikation stellen wir auch ein Protokoll zur Änderung des pT7/NSP3SA11-Plasmids bereit, so dass rekombinante Viren erzeugt werden können, die nicht nur das Segment 7-Proteinprodukt NSP3, sondern auch ein separates FP ausdrücken. Dies wird erreicht, indem der NSP3-Leserahmen (ORF) im pT7/NSP3SA11-Plasmid neu gestaltet wird, um ein nachgeschaltetes 2A-Translational Stop-Restart-Element gefolgt von einem FP ORF (Abbildung 1B)24,26. Durch diesen Ansatz haben wir rekombinante Rotaviren erzeugt, die verschiedene FpPs exdrücken: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)24,27,28. Diese FP-exemitten Rotaviren werden ohne Löschung des NSP3 ORF hergestellt, wodurch Viren entstehen, von denen erwartet wird, dass sie eine vollständige Ergänzung funktionierender viraler Proteine kodieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unserem Labor verlassen wir uns routinemäßig auf das hier beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll, um rekombinante SA11-Rotaviren zu produzieren. Mit diesem Ansatz erholen sich Personen mit wenig Erfahrung in molekularbiologischen Techniken oder der Arbeit mit Rotaviren rekombinante Viren auch beim ersten Versuch. Wir haben nach diesem Protokoll fast 100 rekombinante Viren erzeugt, einschließlich derer mit Genomen, die überarbeitet wurden, um fremde Proteine (z. B. FPs) auszudrücken, die Sequenzadditionen, Löschu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R03 AI131072 und R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding und das Lawrence M. Blatt Endowment unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Labors der IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, und Guido Papa für ihre vielen Beiträge und Anregungen bei der Entwicklung des Reverse Genetics Protokolls.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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