Méthode simplifiée de génétique inversée pour récupérer les rotavirus recombinés exprimant des protéines reporter
Summary
La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.
Abstract
Les rotavirus sont une population importante et évolutive de virus à ARN à double brin segmenté qui causent une gastro-entérite sévère chez les jeunes de nombreuses espèces hôtes mammifères et aviaires, y compris les humains. Avec l’avènement récent des systèmes de génétique inverse du rotavirus, il est devenu possible d’utiliser la mutanèse dirigée pour explorer la biologie du rotavirus, modifier et optimiser les vaccins antirotavirus existants, et développer des vecteurs vaccinaux multitargets rotavirus. Dans ce rapport, nous décrivons un système de génétique inverse simplifié qui permet le rétablissement efficace et fiable des rotavirus recombinants. Le système est basé sur la co-transfection des vecteurs de transcription T7 exprimant le rotavirus pleine longueur (MD) ARN et un vecteur CMV codant une enzyme de plafonnement de l’ARN dans les cellules BHK produisant constitutivement la polyméase d’ARN T7 (BHK-T7). Les rotavirus recombinants sont amplifiés en supervisant les cellules BHK-T7 transfectedes avec des cellules MA104, une lignée de cellules rénales de singe qui est fortement permissive pour la croissance du virus. Dans ce rapport, nous décrivons également une approche pour générer des rotavirus recombinants qui expriment une protéine distincte de reporter fluorescent par l’introduction d’un élément de stop-restart translationnel 2A dans le segment 7 du génome (NSP3). Cette approche évite de supprimer ou de modifier l’un des cadres de lecture ouverts viraux, permettant ainsi la production de rotavirus recombinants qui conservent des protéines virales entièrement fonctionnelles tout en exprimant une protéine fluorescente.
Introduction
Les rotavirus sont des causes majeures de gastro-entérite sévère chez les nourrissons et les jeunes enfants, ainsi que les jeunes de nombreuses autres espèces de mammifères et devian1. En tant que membres de la famille Reoviridae, les rotavirus ont un génome segmenté d’ARN à double brin (ARNN). Les segments du génome sont contenus dans une virion icosahedral nonveloped formée à partir de trois couches concentriques de protéines2. Sur la base du séquençage et de l’analyse phylogénétique des segments du génome, neuf espèces de rotavirus (A-D, F-J) ont été définies3. Ces souches comprenant l’espèce de rotavirus A sont responsables de la grande majorité des maladies humaines4. L’introduction de vaccins antirotavirus dans les programmes de vaccination des enfants à partir de la dernière décennie est corrélée avec des réductions significatives de la mortalité et de la morbidité des rotavirus. Plus particulièrement, le nombre de décès infantiles associés au rotavirus est passé d’environ 528 000 en 2000 à 128 500 en 20164,5. Les vaccins antirotavirus sont formulés à partir de souches vivantes atténuées du virus, avec 2 à 3 doses administrées aux enfants avant l’âge de 6 mois. Le grand nombre de souches de rotavirus génétiquement diverses circulant chez l’homme et d’autres espèces de mammifères, combinée à leur capacité d’évoluer rapidement par la mutagénèse et le réassorignement, peut conduire à des changements antigéniques dans les types de rotavirus infectant les enfants6,7,8. Ces changements peuvent miner l’efficacité des vaccins existants, nécessitant leur remplacement ou leur modification.
Le développement de systèmes de génétique inverse entièrement basés sur le plasmide permettant la manipulation de l’un des 11 segments du génome du rotavirus n’a été réalisé que récemment9. Avec la disponibilité de ces systèmes, il est devenu possible de démêler les détails moléculaires de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, de mettre au point des méthodes améliorées de dépistage à haut débit pour les composés antirotavirus et de créer de nouvelles classes potentiellement plus efficaces de vaccins antirotavirus. Pendant la réplication de rotavirus, les ARN viraux plafonnés ()RN non seulement guident la synthèse des protéines virales, mais servent également de modèles pour la synthèse des segments du génome de l’ARNS10,,11. Tous les systèmes de génétique inverse de rotavirus décrits à ce jour reposent sur la transfection des vecteurs de transcription T7 dans les lignées cellulaires des mammifères comme source d’ARN dérivés de l’ADN pour récupérer les virus recombinés9,12,13. Dans les vecteurs de transcription, les ADNv virales pleine longueur sont positionnées entre un promoteur T7 en amont et le ribozyme du virus du delta de l’hépatite en aval (HDV) de telle sorte que les ARN virales sont synthétisés par la polymérase à ARN T7 qui contiennent des 5′ et 3’termini authentiques(figure 1A). Dans le système de génétique inverse de première génération, des virus recombinants ont été fabriqués en transfectant des cellules rénales de hamster de bébé exprimant la polymérase d’ARN de T7 (BHK-T7) avec des vecteurs de transcription de 11 T7 (pT7), chaque synthèse de direction d’un ARN unique ()RNA de la souche simienne du virus SA11, et trois plasmides d’expression de promoteur-drive CMV, un codant la protéine de fusion de réovirus aviaire p10FAST et deux sous-unités codantes du complexe d’enzymes de plafonnement du virus vaccinia D1R-D12L9. Les virus REcombinants SA11 générés dans les cellules BHK-T7 transfectedes ont été amplifiés en supervisant avec des cellules MA104, une lignée cellulaire permissive pour la croissance du rotavirus. Une version modifiée du système de génétique inverse de première génération a été décrite qui n’utilise plus de plasmides de soutien12. Au lieu de cela, le système modifié génère avec succès des rotavirus recombinés simplement en transfectant les cellules BHK-T7 avec les vecteurs de transcription SA11 T7 11, avec la mise en garde que les vecteurs pour l’usine virale (viroplasme) blocs de construction (protéines nontructurales NSP2 et NSP5) sont ajoutés à des niveaux 3 fois plus élevés que les autres vecteurs14,15. Des versions modifiées du système génétique inverse ont également été développées qui soutiennent la récupération des souches humaines DE KU et Odelia de rotavirus16,17. Le génome du rotavirus est remarquablement favorable à la manipulation par la génétique inverse, avec des virus recombinés générés à ce jour avec des mutations introduites dans VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, et NSP522,23. Parmi les virus les plus utiles générés à ce jour sont ceux qui ont été conçus pour exprimer des protéines de journaliste fluorescent (FPs)9,12,21,24,25.
Dans cette publication, nous fournissons le protocole pour le système génétique inverse que nous utilisons dans notre laboratoire pour générer des souches recombinantes de rotavirus SA11. La caractéristique clé de notre protocole est la co-transfection des cellules BHK-T7 avec les vecteurs de transcription 11 pT7 (modifié pour inclure les niveaux de 3x de la pT7/NSP2SA11 et pT7/NSP5SA11 vecteurs) et un vecteur d’expression CMV codant le virus de la peste porcine africaine (ASFV) NP868R capping enzyme21 (Figure 22). Dans nos mains, la présence du plasmide NP868R conduit à la production de titres plus élevés de virus recombinés par des cellules TRANSfected BHK-T7. Dans cette publication, nous fournissons également un protocole pour modifier le plasmide pT7/NSP3SA11 de telle sorte que des virus recombinés peuvent être générés qui expriment non seulement le produit protéique du segment 7 NSP3, mais aussi un FP distinct. Ceci est accompli en réingénier le cadre de lecture ouverte NSP3 (ORF) dans le plasmide pT7/NSP3SA11 pour contenir un élément d’arrêt-redémarrage translationnel en aval 2A suivi d’un FP ORF(figure 1B)24,26. Grâce à cette approche, nous avons généré des rotavirus recombinés exprimant divers FP: UnaG (vert), mKate (rouge lointain), mRuby (rouge), TagBFP (bleu), CFP (cyan), et YFP (jaune)24,27,28. Ces rotavirus exprimant LE FP sont fabriqués sans supprimer l’ORF NSP3, ce qui donne des virus qui devraient encoder un effectif complet de protéines virales fonctionnelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans notre laboratoire, nous comptons régulièrement sur le protocole de génétique inverse décrit ici pour produire des rotavirus SA11 recombinants. Avec cette approche, les individus ayant peu d’expérience dans les techniques de biologie moléculaire ou de travailler avec des rotavirus récupérer les virus recombinés, même sur leur première tentative. Nous avons généré près de 100 virus recombinés à la suite de ce protocole, y compris ceux dont les génomes ont été repeménent pour exprimer des proté…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R03 AI131072 et R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, et le Lawrence M. Blatt Endowment. Nous remercions les membres du laboratoire IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, et Guido Papa pour leurs nombreuses contributions et suggestions dans l’élaboration du protocole de génétique inversée.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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