Summary

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

Published: April 17, 2020
doi:

Summary

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

Abstract

Rotaviruses הם אוכלוסייה גדולה ומתפתחת של וירוסים כפולה ומקוטע של RNA הגורמות לדלקת במעיים חמורה בצעירים של מינים רבים ומארחים העופות, כולל בני אדם. עם הופעתו האחרונה של רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות, זה הפך להיות אפשרי להשתמש מוטגנזה מכוונת כדי לחקור ביולוגיה רוטוירוס, לשנות ולמטב את הקיימים חיסונים רוטוירוס, ולפתח רוטוירוס רב היעד וקטורים החיסון. בדו ח זה, אנו מתארים מערכת גנטית הפוכה פשוטה המאפשרת התאוששות יעילה ואמינה של רקומביננטי rotaviruses. המערכת מבוססת על שיתוף הפעולה של T7 וקטורים המבטאת באורך מלא רוטוירוס (+) rnas ו-cmv קידוד וקטור האנזים הסגירה לתוך התאים bhk מכונן לייצר T7 RNA פולימראז (bhk-T7). רקומביננטי rotaviruses הם מוגברת על ידי זריעת יתר של תאים BHK-T7 מזוהמים עם תאים MA104, תא כליות קוף קו כי הוא מאוד מתירני עבור צמיחת וירוסים. בדו ח זה, אנו מתארים גם גישה ליצירת רקומביננטי rotaviruses המבטאים חלבון נפרד העיתונאי פלורסנט באמצעות המבוא של האלמנט להפסיק להפעיל מחדש באמצעות translational לקטע הגנום 7 (NSP3). גישה זו נמנעת ממחיקה או שינוי של כל מסגרות קריאה ויראלי פתוח, ובכך לאפשר ייצור של רקומביננטי rotaviruses השומרים חלבונים נגיפי פונקציונלי באופן מלא תוך הבעת ביטוי חלבון פלורסנט.

Introduction

Rotaviruses הם הגורמים העיקריים של דלקת במעיים חמורה אצל תינוקות וילדים צעירים, כמו גם צעירים של יונקים רבים אחרים העופות1. כחברים של המשפחה Reo, וירוסים יש מקוטע כפולה תקוע-RNA (dsRNA) הגנום. מגזרי הגנום כלולים בתוך וויאון לא עטוף שנוצר משלוש שכבות קונצנטריות של חלבון2. מבוסס על רצף וניתוח פילוגנטי של מקטעי הגנום, תשעה מינים של רוטוירוס (A-D, F-J) הוגדרו3. אלה זנים הכוללת מינים רוטוירוס הם אחראים לרוב המכריע של המחלה האנושית4. המבוא של חיסונים רוטוירוס לתוך תוכניות החיסון לילדות החל בעשור האחרון הוא בקורלציה עם הנחות משמעותיות בתמותה רוטוירוס ותחלואה. בעיקר, מספר מקרי המוות של הילדות rotavirus הקשורים ירדו מ כ 528,000 ב 2000 ל 128,500 ב 20164,5. חיסונים rotavirus מנוסחים זני לחיות החליש של הווירוס, עם 2 כדי 3 מינונים מנוהל לילדים על ידי גיל 6 חודשים. המספר הגדול של זנים רוטוירוס ירוס מגוונת גנטית במחזור בני אדם ומינים אחרים היונקים, בשילוב עם יכולתם להתפתח במהירות באמצעות מוטאוסיס והקצאה מראש, עלול להוביל לשינויים אנטיגניים בסוגים של רוטוירוס להדביק ילדים6,7,8. שינויים כאלה עלולים לערער את היעילות של חיסונים קיימים, המחייבים החלפת או שינוי שלהם.

התפתחות של מערכות גנטיקה הפוכה במלואו בסיס המאפשר מניפולציה של כל 11 מקטעי הגנום רוטוירוס הושגה רק לאחרונה9. עם הזמינות של מערכות אלה, זה הפך להיות אפשרי לפענח פרטים מולקולריים של שכפול רוטוירוס ו פתוגנזה, כדי לפתח שיפור תפוקה גבוהה שיטות ההקרנה עבור תרכובות אנטי-רוטוירוס, וכיצד ליצור מחלקות חדשות פוטנציאלי יותר יעיל של חיסונים רוטוירוס. במהלך שכפול רוטוירוס, הכתיר ויראלי (+) rnas לא רק מדריך סינתזה של חלבונים ויראלי, אלא גם לשמש כתבניות לסינתזה של צאצאי הגנום dsrna מגזרים10,11. כל רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות שתוארו עד תאריך להסתמך על הT7 של שעתוק וקטורים לתוך שורות התא של היונקים כמקור cdna-נגזר (+) rnas בשימוש בשחזור רקומביננטי וירוסים9,12,13. בתוך וקטורים שעתוק, cDNAs באורך מלא ממוקמים בין היזם T7 במעלה למטה הפטיטיס דלתא וירוס (HDV) ריבוזים כגון זה ויראלי (+) RNAs מסונתז על ידי T7 RNA פולימראז המכילים אותנטי 5 ‘ ו 3 ‘-termini (איור 1A). במערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון, וירוסים רקומביננטי נעשו על ידי התינוק מצפה בתאי כליה אוגר ביטוי T7 RNA פולימראז (bhk-T7) עם 11 T7 (pT7) תמלול וקטורים, כל מכוון סינתזה של ייחודי (+) RNA של מאמץ SA11 וירוס קופיים, ושלושה cmv יזם-כונן ביטוי פלמידים, קידוד אחד החלבון reovirus p10FAST היתוך ושני חלבוניות קידוד של vaccinia וירוס D1R-D12L הסגירה אנזים מורכב9. וירוסים רקומביננטי SA11 שנוצרו בתאי bhk-T7 מזוהמים היו מוגבר על ידי זריעה יתר עם MA104 תאים, קו תא מתירני עבור צמיחה רוטוירוס. גירסה ששונתה של מערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון תוארה שכבר לא משתמשת ב-פלמידים תומכים12. במקום, המערכת ששונתה מייצרת בהצלחה רקומביננטי rotaviruses פשוט על ידי transfecting T7 תאים ב-hk עם 11 SA11 שעתוק וקטורים, עם האזהרה כי וקטורים עבור המפעל ויראלי (viroפלסטיות) אבני בניין (חלבונים לא מבניים NSP2 ו NSP5) מתווספים ברמות 3 מתקפל גבוה יותר מאשר וקטורים אחרים14,15. גרסאות ששונו של מערכת הגנטיקה הפוכה פותחו גם כי תמיכה ההתאוששות של קו האדם ו אודליה וזנים של רוטוירוס16,17. הגנום רוטוירוס היא קלה להפליא מניפולציה על ידי הפוך גנטיקה, עם רקומביננטי וירוסים שנוצרו עד היום עם מוטציות הציג לתוך VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, ו NSP522,23. בין הווירוסים השימושיים ביותר שנוצר עד כה הם אלה שעברו הנדסה לבטא חלבונים כתב פלורסנט (FPs)9,12,21,24,25.

בפרסום זה, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת הגנטיקה הפוכה שאנו משתמשים במעבדה שלנו כדי לייצר רקומביננטי זנים של SA11 rotavirus. התכונה המפתח של הפרוטוקול שלנו היא שיתוף של התאים BHK-T7 עם 11 pT7 וקטורים (שונה לכלול רמות 3x של pT7/NSP2SA11 ו pT7/NSP5SA11 וקטורים) ו-CMV ביטוי קידוד וקטור החזירים האפריקאי (ASFV) NP868R סגירה אנזים21 (איור 2). בידינו, נוכחות של NP868R באמצע מוביל את הייצור של מגדל גבוה יותר של וירוסים רקומביננטי על ידי מנוכר bhk-T7 תאים. בפרסום זה, אנו מספקים גם פרוטוקול עבור שינוי pT7/NSP3SA11 הפלמיד כגון הרקומביננטי וירוסים ניתן ליצור כי לבטא לא רק את המוצר 7 מוצר חלבון NSP3 אלא גם FP נפרד. זה מושגת על ידי מחדש הנדסה NSP3 פתוח מסגרת הקריאה (orf) ב pT7/NSP3SA11 פלמיד להכיל במורד הזרם 2a לעצור הפעלה מחדש האלמנט ואחריו FP (איור 1b)24,26. באמצעות גישה זו, יצרנו רקומביננטי rotaviruses ביטוי FPs שונים: unag (ירוק), mkate (רחוק-אדום), mkate (אדום), tagbfp (כחול), CFP (ציאן), ו-yfp (צהוב)24,27,28. אלה וירוסים FP ביטוי זה נעשים מבלי למחוק את NSP3 ORF, ובכך וירוסים מניבים כי צפויים לקודד השלמה מלאה של התפקוד חלבונים נגיפי.

Protocol

1. הכנת מדיה ותחזוקת תרבות תאים להשיג כליות אוגר התינוק בתאי ביטוי מבחינה T7 RNA פולימראז (BHK-T7) ו אפריקה ירוק כליות הקוף MA104 תאים.הערה: BHK-T7 (או בסר-T7) תאים אינם זמינים מסחרית, אבל הם קו התא המשותף של מעבדות באמצעות גנטיקה הפוכה ללמוד ביולוגיה של וירוס RNA. קו BHK-T7 בשימוש בפרוטוקול זה הושג ד ר….

Representative Results

הפרוטוקול הגנטי הפוך המתואר במאמר זה ההכנסות דרך מספר שלבים מובחנת: (1) שיתוף הפעולה של תאים bhk-T7 עם וקטורים שעתוק רוטוירוס pT7 ו pcmv/NP868R ביטוי פלאמאמצע, (2) זריעת יתר של תאים מזוהמים bhk-T7 עם MA104 תאים, (3) הגברה של רקומביננטי וירוסים הנמצאים bhk-T7/MA104 תאים lysates באמצעות תאים MA104, ו (4) פלאק בידוד של רקומבינ…

Discussion

במעבדה שלנו, אנו סומכים באופן שגרתי על הפרוטוקול גנטיקה הפוכה המתוארת בזאת כדי לייצר רקומביננטי SA11 rotaviruses. עם גישה זו, אנשים עם ניסיון קטן בטכניקות ביולוגיה מולקולרית או עבודה עם rotaviruses לשחזר וירוסים רקומביננטי גם בניסיון הראשון שלהם. יצרנו קרוב 100 וירוסים רקומביננטי בעקבות פרוטוקול זה, כו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים R03 AI131072 ו R21 AI144881, מימון הסטארט-Up של אוניברסיטת אינדיאנה, ואת קרן לורנס M.. אנו מודים לחברי מעבדת הרנטגן של המעבדה, אולריך דסלברגר, וגואידו פאפא בגין תרומותיהם הרבות והצעותיהם בפיתוח פרוטוקול הגנטיקה הפוכה.

Materials

Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Bio-Rad 45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System Bio-Rad
Chloroform MP 194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate Bio-Rad 170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria Lucigen 60602-2
Complete Protease Inhibitor Pierce A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips MTC Bio P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) Quality Biological 115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof) Fisher Bioreagents BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Corning 35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal Sigma-Aldrich F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit Sigma NA0200-1KT
Geneticin (G-418) Invitrogen 10131-027
Gibco FluroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum Patton lab lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum Patton lab lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated KPL 5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit JH Science 25235
Isopropyl alcohol Macron 3032-02
L-glutamine Solution (100x) Gibco 25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) RPI research products L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium Hyclone Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) Lonza 04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells ATCC ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%) Sigma-Aldrich N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) Gibco 11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Invitrogen XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water Invitrogen 10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit Takara 740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable) Fisher 12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Bioreagents BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S Sigma-Aldrich T0303
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
SA11 pT7 Transcription Vectors Addgene 89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose Lonza 50000 For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose Lonza 50100 For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit Invitrogen 12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) Bio-Rad 161-0772
Triton X 100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent Ambion 15596026
Trypan blue Corning 25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution Quality Biological 118-087-721
Tryptose Phosphate Broth Gibco 18050-039
Tween-20 VWR 0777-1L
Vertrel VF solvent Zoro G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager Bio-Rad

References

  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

Play Video

Cite This Article
Philip, A. A., Dai, J., Katen, S. P., Patton, J. T. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (158), e61039, doi:10.3791/61039 (2020).

View Video