Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

Asha  A. Philip; Jin Dai; Sarah P. Katen; John  T. Patton

doi:10.3791/61039

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Articolo metodologico

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

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DOI:

10.3791/61039

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17 aprile 2020

Asha A. Philip¹ , Jin Dai¹ , Sarah P. Katen¹ , John T. Patton¹

¹Department of Biology, Indiana University

In questo articolo

Sommario

La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.

Abstract

I rotavirus sono una grande e in continua evoluzione di virus segmentati dell'RNA a doppio filamento che causano una grave gastroenterite nei giovani di molte specie di mammiferi e aviari, compresi gli esseri umani. Con il recente avvento dei sistemi di genetica inversa del rotavirus, è diventato possibile utilizzare la mutagenesi diretta per esplorare la biologia del rotavirus, modificare e ottimizzare i vaccini esistenti sul rotavirus e sviluppare vettori di vaccino multitarget del rotavirus. In questa relazione, descriviamo un sistema di genetica inversa semplificato che consente il recupero efficiente e affidabile dei rotavirus ricombinanti. Il sistema si basa sulla co-trascrizione di vettori di trascrizione T7 che esprimono rotavirus a lunghezza intera e su un vettore CMV che codifica un enzima di aggancio dell'RNA nelle cellule BHK producendo constitutively produrre polimerasi T7 RNA (BHK-T7). I rotavirus ricombinanti sono amplificati sovrasseminando le cellule BHK-T7 trafette con cellule MA104, una linea cellulare renale delle scimmie che è altamente permissiva per la crescita del virus. In questo rapporto, descriviamo anche un approccio per generare rotavirus ricombinanti che esprimono una proteina reporter fluorescente separata attraverso l'introduzione di un elemento di stop-restart traslazionale 2A nel segmento 7 del genoma (NSP3). Questo approccio evita di cancellare o modificare uno qualsiasi dei fotogrammi di lettura aperti virali, consentendo così la produzione di rotavirus ricombinanti che mantengono proteine virali completamente funzionali e allo stesso tempo di esprimere una proteina fluorescente.

Introduzione

I rotavirus sono le principali cause di gastroenterite grave nei neonati e nei bambini piccoli, così come i giovani di molti altri mammiferi e specie aviarie¹. Come membri della famiglia Reoviridae, i rotavirus hanno un genoma di RNA a doppio filamento (dsRNA) segmentato. I segmenti del genoma sono contenuti all'interno di un virione icosaedro non avvolto formato da tre strati concentrici di proteine². Sulla base del sequenziamento e dell'analisi filogenetica dei segmenti del genoma, sono state definite nove specie di rotavirus (A, D, F,J)³. I ceppi che comprendono la specie a rotavirus A....