Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter
Summary
La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.
Abstract
I rotavirus sono una grande e in continua evoluzione di virus segmentati dell’RNA a doppio filamento che causano una grave gastroenterite nei giovani di molte specie di mammiferi e aviari, compresi gli esseri umani. Con il recente avvento dei sistemi di genetica inversa del rotavirus, è diventato possibile utilizzare la mutagenesi diretta per esplorare la biologia del rotavirus, modificare e ottimizzare i vaccini esistenti sul rotavirus e sviluppare vettori di vaccino multitarget del rotavirus. In questa relazione, descriviamo un sistema di genetica inversa semplificato che consente il recupero efficiente e affidabile dei rotavirus ricombinanti. Il sistema si basa sulla co-trascrizione di vettori di trascrizione T7 che esprimono rotavirus a lunghezza intera e su un vettore CMV che codifica un enzima di aggancio dell’RNA nelle cellule BHK producendo constitutively produrre polimerasi T7 RNA (BHK-T7). I rotavirus ricombinanti sono amplificati sovrasseminando le cellule BHK-T7 trafette con cellule MA104, una linea cellulare renale delle scimmie che è altamente permissiva per la crescita del virus. In questo rapporto, descriviamo anche un approccio per generare rotavirus ricombinanti che esprimono una proteina reporter fluorescente separata attraverso l’introduzione di un elemento di stop-restart traslazionale 2A nel segmento 7 del genoma (NSP3). Questo approccio evita di cancellare o modificare uno qualsiasi dei fotogrammi di lettura aperti virali, consentendo così la produzione di rotavirus ricombinanti che mantengono proteine virali completamente funzionali e allo stesso tempo di esprimere una proteina fluorescente.
Introduction
I rotavirus sono le principali cause di gastroenterite grave nei neonati e nei bambini piccoli, così come i giovani di molti altri mammiferi e specie aviarie1. Come membri della famiglia Reoviridae, i rotavirus hanno un genoma di RNA a doppio filamento (dsRNA) segmentato. I segmenti del genoma sono contenuti all’interno di un virione icosaedro non avvolto formato da tre strati concentrici di proteine2. Sulla base del sequenziamento e dell’analisi filogenetica dei segmenti del genoma, sono state definite nove specie di rotavirus (A, D, F,J)3. I ceppi che comprendono la specie a rotavirus A sono responsabili della stragrande maggioranza delle malattie umane4. L’introduzione di vaccini rotavirus nei programmi di immunizzazione infantile a partire dall’ultimo decennio è correlata a riduzioni significative della mortalità e morbilità del rotavirus. In particolare, il numero di decessi infantili associati al rotavirus è diminuito da circa 528.000 nel 2000 a 128.500 nel 20164,5. I vaccini Rotavirus sono formulati da ceppi vivi attenuati del virus, con 2 a 3 dosi somministrate ai bambini entro i 6 mesi di età. Il gran numero di ceppi di rotavirus geneticamente diversi che circolano negli esseri umani e in altre specie di mammiferi, combinato con la loro capacità di evolversi rapidamente attraverso la mutagenesi e il riassortimento, può portare a cambiamenti antigenici nei tipi di rotavirus che infettano i bambini6,7,8. Tali cambiamenti possono compromettere l’efficacia dei vaccini esistenti, richiedendone la sostituzione o la modifica.
Lo sviluppo di sistemi di genetica inversa completamente basati su plasmide che consentono la manipolazione di uno qualsiasi degli 11 segmenti del genoma del rotavirus è stato raggiunto solo di recente9. Con la disponibilità di questi sistemi, è diventato possibile svelare i dettagli molecolari della replicazione del rotavirus e della patogenesi, sviluppare migliori metodi di screening ad alto throughput per i composti anti-rotavirus e creare nuove classi potenzialmente più efficaci di vaccini rotavirus. Durante la replicazione del rotavirus, gli RNA con tappo non solo guidano la sintesi delle proteine virali, ma fungono anche da modelli per la sintesi dei segmenti del genoma della progenie dsRNA10,11. Tutti i sistemi di genetica inversa del rotavirus descritti fino ad oggi si basano sulla trasfezione dei vettori di trascrizione T7 nelle linee cellulari dei mammiferi come fonte di RNA derivati da cDNA , utilizzati per recuperare virus ricombinanti9,12,13. All’interno dei vettori di trascrizione, i cDNA virali a tutta lunghezza sono posizionati tra un promotore T7 a monte e il virus dell’epatite delta a valle (HDV) ribozyme in modo tale che gli RNA virali sono sintetizzati da polimerasi T7 RNA che contengono autentici 5′ e 3 termini(Figura 1A). Nel sistema di genetica inversa di prima generazione, i virus ricombinanti sono stati fatti traducendo cellule renali del criceto per bambini che esprimono la polimerasi t7 RNA (BHK-T7) con 11 vettori di trascrizione T7 (pT7), ogni sintesi diretta di un unico (-)RNA del ceppo virus simian SA11, e tre plasmidi di espressione promotore-drive CMV, uno che codifica la proteina di fusione aviaria reovirus p10FAST e due sottounità di codifica del virus vaccini D1R-D12L filare enzima complesso9. I virus SA11 ricombinanti generati nelle cellule BHK-T7 trasfette sono stati amplificati dal semina con cellule MA104, una linea cellulare permissiva per la crescita del rotavirus. È stata descritta una versione modificata del sistema di genetica inversa di prima generazione che non utilizza più plasmidi di supporto12. Invece, il sistema modificato genera con successo rotavirus ricombinanti semplicemente traducendo le cellule BHK-T7 con i 11 vettori di trascrizione SA11 T7, con l’avvertenza che i vettori per la fabbrica virale (viroplasmo) blocchi costitutivi (proteine non strutturali NSP2 e NSP5) vengono aggiunti a livelli 3 volte superiori rispetto agli altri vettori14,15. Sono state sviluppate anche versioni modificate del sistema di genetica inversa che supportano il recupero dei ceppi umani KU e Odelia del rotavirus16,17. Il genoma del rotavirus è notevolmente suscettibile alla manipolazione da parte della genetica inversa, con virus ricombinanti generati fino ad oggi con mutazioni introdotte in VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21e NSP522,23. Tra i virus più utili generati finora ci sono quelli che sono stati progettati per esprimere proteine reporter fluorescenti (FP)9,12,21,24,25.
In questa pubblicazione, forniamo il protocollo per il sistema di genetica inversa che usiamo nel nostro laboratorio per generare ceppi ricombinanti del rotavirus SA11. La caratteristica chiave del nostro protocollo è la co-transfezione delle cellule BHK-T7 con i vettori di trascrizione 11 pT7 (modificati per includere livelli 3x dei vettori pT7/NSP2SA11 e pT7/NSP5SA11) e unFigure 2vettore di espressione CMV che codifica il virus della peste suina africana (ASFV) NP868R).21 Nelle nostre mani, la presenza del plasmide NP868R porta alla produzione di più alti titer di virus ricombinanti da parte di cellule BHK-T7 trafette. In questa pubblicazione, forniamo anche un protocollo per modificare il pLasmide pT7/NSP3SA11 in modo che possano essere generati virus ricombinanti che esprimono non solo il prodotto proteico segmento 7 NSP3 ma anche un FP separato. Questa operazione viene eseguita ri-ingegnerizzando il frame di lettura aperto NSP3 (ORF) nel plasmid pT7/NSP3SA11 per contenere un elemento downstream 2A di arresto traslazionale 2A seguito da un FP ORF (Figura 1B)24,26. Attraverso questo approccio, abbiamo generato rotavirus ricombinanti che esprimono vari FP: UnaG (verde), mKate (molto rosso), mRuby (rosso), TagBFP (blu), CFP (ciano) e YFP (giallo)24,27,28. Questi rotavirus che esprimono FP sono fatti senza eliminare l’OrF NSP3, producendo così virus che dovrebbero codificare un completo complemento di proteine virali funzionanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel nostro laboratorio, ci affidiamo regolarmente al protocollo di genetica inversa descritto qui per produrre rotavirus SA11 ricombinanti. Con questo approccio, gli individui con poca esperienza nelle tecniche di biologia molecolare o che lavorano con i rotavirus recuperano i virus ricombinanti anche al loro primo tentativo. Abbiamo generato quasi 100 virus ricombinanti seguendo questo protocollo, compresi quelli con genomi che sono stati riprogettati per esprimere proteine estranee (ad esempio, SP) e che contengono agg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni R03 AI131072 e R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, e il Lawrence M. Blatt Endowment. Ringraziamo i membri del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, e Guido Papa per i loro numerosi contributi e suggerimenti nello sviluppo del protocollo di genetica inversa.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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