Método de genética reversa simplificado para recuperar rotavírus recombinantes expressando proteínas de repórter
Summary
A geração de rotavírus recombinantes a partir do DNA plasmático fornece uma ferramenta essencial para o estudo da replicação de rotavírus e patogênese, e o desenvolvimento de vetores e vacinas de expressão rotavírus. Aqui, descrevemos uma abordagem genética reversa simplificada para a geração de rotavírus recombinantes, incluindo cepas expressando proteínas fluorescentes de repórteres.
Abstract
Os rotavírus são uma população grande e em evolução de vírus de RNA segmentados de dupla cadeia que causam gastroenterite severa em jovens de muitas espécies de mamíferos e hospedeiros aviários, incluindo os humanos. Com o recente advento dos sistemas de genética reversa do rotavírus, tornou-se possível usar mutagênese direcionada para explorar a biologia do rotavírus, modificar e otimizar as vacinas rotavírus existentes e desenvolver vetores de vacinas multialvo rotavírus. Neste relatório, descrevemos um sistema de genética reversa simplificado que permite a recuperação eficiente e confiável de rotavírus recombinantes. O sistema baseia-se na cofecção de vetores de transcrição T7 expressando rotavírus de comprimento total (+)RNAs e um vetor CMV codificando uma enzima de capping de RNA em células BHK que produzem comstitutivamente a polimerase De T7 RNA (BHK-T7). Os rotavírus recombinantes são amplificados pela supervisão das células BHK-T7 transfeccionadas com células MA104, uma linha de células renais de macaco que é altamente permissiva para o crescimento do vírus. Neste relatório, também descrevemos uma abordagem para a geração de rotavírus recombinantes que expressam uma proteína repórter fluorescente separada através da introdução de um elemento de parada translacional 2A no segmento genoma 7 (NSP3). Esta abordagem evita excluir ou modificar qualquer um dos quadros de leitura abertos virais, permitindo assim a produção de rotavírus recombinantes que retêm proteínas virais totalmente funcionais enquanto expressam uma proteína fluorescente.
Introduction
Os rotavírus são as principais causas de gastroenterite grave em bebês e crianças pequenas, bem como os filhotes de muitas outras espécies de mamíferos e aviários1. Como membros da família Reoviridae, os rotavírus têm um genoma de RNA de dupla cadeia segmentada (dsRNA). Os segmentos do genoma estão contidos dentro de uma virion icosaedro não envolta formada a partir de três camadas concêntricas de proteína2. Com base no sequenciamento e análise filogenética dos segmentos do genoma, foram definidas nove espécies de rotavírus (A−D, F−J)3. Essas cepas que compreendem a espécie rotavírus A são responsáveis pela grande maioria da doença humana4. A introdução de vacinas rotavírus em programas de imunização infantil a partir da última década está correlacionada com reduções significativas na mortalidade e morbidade de rotavírus. Mais notavelmente, o número de mortes infantis associadas ao rotavírus diminuiu de aproximadamente 528.000 em 2000 para 128.500 em 20164,5. As vacinas rotavírus são formuladas a partir de cepas atenuantes vivas do vírus, com 2 a 3 doses administradas em crianças até 6 meses de idade. O grande número de cepas de rotavírus geneticamente diversas que circulam em humanos e outras espécies de mamíferos, combinadas com sua capacidade de evoluir rapidamente através de mutagênese e reclassificação, pode levar a alterações antigênicas nos tipos de rotavírus que infectam crianças6,7,8. Tais alterações podem minar a eficácia das vacinas existentes, exigindo sua substituição ou modificação.
O desenvolvimento de sistemas de genética reversa totalmente baseados em plasmídeos que permitem a manipulação de qualquer um dos 11 segmentos do genoma rotavírus foi alcançado recentemente9. Com a disponibilidade desses sistemas, tornou-se possível desvendar detalhes moleculares de replicação de rotavírus e patogênese, desenvolver métodos aprimorados de triagem de alto desempenho para compostos anti-rotavírus e criar novas classes potencialmente mais eficazes de vacinas rotavírus. Durante a replicação do rotavírus, as RNAs virais (+)não só orientam a síntese de proteínas virais, mas também servem como modelos para a síntese dos segmentos do genoma dsRNA da progêia10,11. Todos os sistemas genéticos reversos de rotavírus descritos até hoje dependem da transfecção de vetores de transcrição T7 em linhas celulares de mamíferos como fonte de cDNA derivado (+)RNAs usados na recuperação de vírus recombinantes9,,12,13. Dentro dos vetores de transcrição, os cDNAs virais de comprimento completo são posicionados entre um promotor T7 a montante e o ribozyme de hepatite delta (HDV) de tal forma que as rnas virais (+)RNAs são sintetizadas por polimerase T7 RNA que contêm autênticos 5′ e 3′-termini(Figura 1A). No sistema de genética reversa de primeira geração, os vírus recombinantes foram feitos por células renais de hamster de bebê transfeccionaexpressas T7 RNA polimerase (BHK-T7) com 11 vetores de transcrição T7 (pT7), cada uma síntese direcional de um Único (+)RNA da cepa do vírus SA11 símio, e três plasmídeos de expressão de unidade de promotor cmv, um codificando a proteína de fusão aviária reovirus p10FAST e duas subunidades codificadoras do vírus da vaccinia D1R-D12L capping enzima complexo9. Os vírus SA11 recombinantes gerados em células BHK-T7 transfeccionadas foram amplificados pela supervisão com células MA104, uma linha celular permissiva para o crescimento de rotavírus. Uma versão modificada do sistema de genética reversa de primeira geração foi descrita que não usa mais plasmídeos de suporte12. Em vez disso, o sistema modificado gera com sucesso rotavírus recombinantes simplesmente transfecting células BHK-T7 com os vetores de transcrição 11 SA11 T7, com a ressalva de que os vetores para os blocos de construção da fábrica viral (viroplasma) (proteínas não estruturais NSP2 e NSP5) são adicionados a níveis 3 vezes maiores que os outros vetores14,15. Também foram desenvolvidas versões modificadas do sistema genético reverso que suportam a recuperação das cepas humanas de KU e Odelia do rotavírus16,17. O genoma rotavírus é notavelmente passível de manipulação por genética reversa, com vírus recombinantes gerados até hoje com mutações introduzidas em VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, e NSP522,23. Entre os vírus mais úteis gerados até agora estão aqueles que foram projetados para expressar proteínas fluorescentes de repórteres (FPs)9,12,21,24,25.
Nesta publicação, fornecemos o protocolo para o sistema de genética reversa que usamos em nosso laboratório para gerar cepas recombinantes de rotavírus SA11. A principal característica do nosso protocolo é a cofecção de células BHK-T7 com os vetores de transcrição 11 pT7 (modificados para incluir níveis de 3x da enzima de capping pT7/NSP2SA11 e pT7/NSP5SA11) e um vetor de expressão CMV codificando o vírus da peste suína africana (ASFV) NP868R enzique21 (Figura 2). Em nossas mãos, a presença do plasmídeo NP868R leva à produção de títulos mais altos de vírus recombinantes por células BHK-T7 transfeccionadas. Nesta publicação, também fornecemos um protocolo para modificar o plasmídeo pT7/NSP3SA11 para que vírus recombinantes possam ser gerados que expressem não apenas o produto de proteína nSP3 do segmento 7, mas também um FP separado. Isso é feito pela reengenharia do quadro de leitura aberta NSP3 (ORF) no plasmídeo pT7/NSP3SA11 para conter um elemento de reinicialização translacional 2A a jusante seguido de um FP ORF(Figura 1B)24,26. Através desta abordagem, geramos rotavírus recombinantes expressando vários FPs: UnaG (verde), mKate (vermelho distante), mRuby (vermelho), TagBFP (azul), CFP (ciano) e YFP (amarelo)24,27,28. Esses rotavírus que expressam FP são feitos sem excluir o NSP3 ORF, produzindo assim vírus que devem codificar um complemento completo de proteínas virais em funcionamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em nosso laboratório, contamos rotineiramente com o protocolo genético reverso descrito aqui para produzir rotavírus SA11 recombinantes. Com essa abordagem, indivíduos com pouca experiência em técnicas de biologia molecular ou trabalhando com rotavírus recuperam vírus recombinantes mesmo em sua primeira tentativa. Geramos cerca de 100 vírus recombinantes seguindo este protocolo, incluindo aqueles com genomas que foram reprojetados para expressar proteínas estrangeiras (por exemplo, FPs) e que contêm adições …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R03 AI131072 e R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, e lawrence M. Blatt Endowment. Agradecemos aos membros do laboratório Rotahoosier da UI, Ulrich Desselberger e Guido Papa por suas muitas contribuições e sugestões no desenvolvimento do protocolo genético reverso.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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