Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero
Summary
La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.
Abstract
Los rotavirus son una población grande y en evolución de virus de ARN segmentados de doble cadena que causan gastroenteritis grave en los jóvenes de muchas especies de mamíferos y aves, incluidos los seres humanos. Con la reciente llegada de los sistemas de genética inversa del rotavirus, se ha hecho posible utilizar la mutagénesis dirigida para explorar la biología del rotavirus, modificar y optimizar las vacunas rotavirus existentes y desarrollar vectores de vacunas multiobjetivo de rotavirus. En este informe, describimos un sistema de genética inversa simplificado que permite la recuperación eficiente y confiable de rotavirus recombinantes. El sistema se basa en la co-transfección de vectores de transcripción T7 que expresan rotavirus de longitud completa (+)ARN y un vector CMV que codifica una enzima de tapado de ARN en células BHK que producen constitutivamente la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7). Los rotavirus recombinantes se amplifican mediante la sosción de las células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, una línea de células renales de monos que es altamente permisiva para el crecimiento del virus. En este informe, también describimos un enfoque para generar rotavirus recombinantes que expresan una proteína de reportero fluorescente separada a través de la introducción de un elemento de parada-reinicio traslacional 2A en el segmento 7 del genoma (NSP3). Este enfoque evita eliminar o modificar cualquiera de los marcos de lectura abiertos virales, permitiendo así la producción de rotavirus recombinantes que retienen proteínas virales totalmente funcionales mientras expresan una proteína fluorescente.
Introduction
Los rotavirus son las principales causas de gastroenteritis grave en lactantes y niños pequeños, así como en los jóvenes de muchas otras especies de mamíferos y aves1. Como miembros de la familia Reoviridae, los rotavirus tienen un genoma segmentado de ARN de doble cadena (dsRNA). Los segmentos del genoma están contenidos dentro de un virión icosahedral no envuelto formado a partir de tres capas concéntricas de proteína2. Sobre la base de la secuenciación y el análisis filogenético de los segmentos del genoma, se han definido nueve especies de rotavirus (A-D, F-J)3. Esas cepas que comprenden la especie de rotavirus A son responsables de la gran mayoría de las enfermedades humanas4. La introducción de vacunas contra el rotavirus en los programas de inmunización infantil a partir de la última década está correlacionada con reducciones significativas en la mortalidad y la morbilidad del rotavirus. En particular, el número de muertes infantiles asociadas al rotavirus ha disminuido de aproximadamente 528.000 en 2000 a 128.500 en 20164,5. Las vacunas contra el rotavirus se formulan a partir de cepas vivas atenuadas del virus, con 2 a 3 dosis administradas a niños a los 6 meses de edad. El gran número de cepas de rotavirus genéticamente diversas que circulan en humanos y otras especies de mamíferos, combinadas con su capacidad de evolucionar rápidamente a través de la mutagénesis y el reordenamiento, puede dar lugar a cambios antigénicos en los tipos de rotavirus que infectan a niños6,7,8. Estos cambios pueden socavar la eficacia de las vacunas existentes, lo que requiere su sustitución o modificación.
El desarrollo de sistemas de genética inversa totalmente basados en plásmidos que permiten la manipulación de cualquiera de los 11 segmentos del genoma del rotavirus se logró recientemente9. Con la disponibilidad de estos sistemas, se ha hecho posible desentrañar los detalles moleculares de la replicación del rotavirus y la patogénesis, desarrollar métodos mejorados de detección de alto rendimiento para los compuestos anti-rotavirus y crear nuevas clases potencialmente más eficaces de vacunas contra el rotavirus. Durante la replicación del rotavirus, los arnvirales (+)ARN no sólo guían la síntesis de proteínas virales, sino que también sirven como plantillas para la síntesis de la progenie dsRNA genome segmentos10,11. Todos los sistemas de genética inversa rotavirus descritos hasta la fecha se basan en la transfección de vectores de transcripción T7 en líneas celulares de mamíferos como fuente de ARN derivados del ADNC (+)ARN utilizados en la recuperación de virus recombinantes9,12,13. Dentro de los vectores de transcripción, los cDNa virales de longitud completa se colocan entre un promotor t7 ascendente y el ribozyme del virus delta de la hepatitis (HDV) aguas abajo, de tal manera que los virales (+)ARN son sintetizados por la polimerasa de ARN T7 que contienen 5′ y 3′-termini auténticos (Figura 1A). En el sistema de genética inversa de primera generación, los virus recombinantes se hicieron transfectando células renales de hámster bebé que expresaban la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7) con 11 vectores de transcripción T7 (pT7), cada síntesis de dirección de un ARN único (+)de la cepa del virus SA11 simio, y tres plásmidos de expresión promotor-drive promotor de CMV, uno que codifica la proteína de fusión reovirus aviar p10FAST y dos subunidades codificantes del complejo de enzimas de tapado del virus de la vacuna D1R-D12L9. Los virus SA11 recombinantes generados en células BHK-T7 transinfectadas se amplificaron mediante la sustitución con células MA104, una línea celular permisiva para el crecimiento del rotavirus. Se ha descrito una versión modificada del sistema de genética inversa de primera generación que ya no utiliza plásmidos de soporte12. En su lugar, el sistema modificado genera con éxito rotavirus recombinantes simplemente transfectando células BHK-T7 con los 11 vectores de transcripción SA11 T7, con la advertencia de que los vectores para la fábrica viral (viroplasmo) bloques de construcción (proteínas no estructurales NSP2 y NSP5) se añaden a niveles 3 veces más altos que los otros vectores14,15. También se han desarrollado versiones modificadas del sistema de genética inversa que apoyan la recuperación de las cepas humanas KU y Odelia del rotavirus16,,17. El genoma del rotavirus es notablemente susceptible de manipulación por genética inversa, con virus recombinantes generados hasta la fecha con mutaciones introducidas en VP418,NSP19, NSP219, NSP320,,21y NSP522,,23. Entre los virus más útiles generados hasta el momento se encuentran los que han sido diseñados para expresar proteínas de reportero fluorescente (FP)9,,12,,21,24,25.
En esta publicación, proporcionamos el protocolo para el sistema de genética inversa que utilizamos en nuestro laboratorio para generar cepas recombinantes de rotavirus SA11. La característica clave de nuestro protocolo es la co-transfección de células BHK-T7 con los vectores de transcripción 11 pT7 (modificados para incluir niveles 3x de los vectores pT7/NSP2SA11 y pT7/NSP5SA11) y un vector de expresión CMV que codifica laenzima np868R(Figura 2). En nuestras manos, la presencia del plásmido NP868R conduce a la producción de tetas más altas de virus recombinantes por células BHK-T7 transinfectadas. En esta publicación, también proporcionamos un protocolo para modificar el plásmido pT7/NSP3SA11 de tal manera que se puedan generar virus recombinantes que expresen no sólo el producto proteico del segmento 7 NSP3, sino también un FP separado. Esto se logra reingeniería el marco de lectura abierta (ORF) NSP3 en el plásmido pT7/NSP3SA11 para contener un elemento de detención-reinicio traslacional 2A descendente seguido de un FP ORF (Figura 1B)24,26. A través de este enfoque, hemos generado rotavirus recombinantes que expresan varios FP: UnaG (verde), mKate (rojo lejano), mRuby (rojo), TagBFP (azul), CFP (cian) y YFP (amarillo)24,,27,28. Estos rotavirus de expresión de FP se fabrican sin eliminar el NSP3 ORF, produciendo así virus que se espera que codifican un complemento completo de proteínas virales que funcionan.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nuestro laboratorio, nos basamos rutinariamente en el protocolo de genética inversa descrito aquí para producir rotavirus SA11 recombinantes. Con este enfoque, las personas con poca experiencia en técnicas de biología molecular o el trabajo con rotavirus recuperan virus recombinantes incluso en su primer intento. Hemos generado cerca de 100 virus recombinantes siguiendo este protocolo, incluidos aquellos con genomas que han sido rediseñados para expresar proteínas extrañas (por ejemplo, FPs) y que contienen adi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones De NIH R03 AI131072 y R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, y el Lawrence M. Blatt Endowment. Agradecemos a los miembros del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, y Guido Papa por sus muchas contribuciones y sugerencias en el desarrollo del protocolo de genética inversa.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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