La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.
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Artículo de método
Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero
En este artículo
Resumen
Resumen
Los rotavirus son una población grande y en evolución de virus de ARN segmentados de doble cadena que causan gastroenteritis grave en los jóvenes de muchas especies de mamíferos y aves, incluidos los seres humanos. Con la reciente llegada de los sistemas de genética inversa del rotavirus, se ha hecho posible utilizar la mutagénesis dirigida para explorar la biología del rotavirus, modificar y optimizar las vacunas rotavirus existentes y desarrollar vectores de vacunas multiobjetivo de rotavirus. En este informe, describimos un sistema de genética inversa simplificado que permite la recuperación eficiente y confiable de rotavirus recombinantes. El sistema se basa en la co-transfección de vectores de transcripción T7 que expresan rotavirus de longitud completa (+)ARN y un vector CMV que codifica una enzima de tapado de ARN en células BHK que producen constitutivamente la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7). Los rotavirus recombinantes se amplifican mediante la sosción de las células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, una línea de células renales de monos que es altamente permisiva para el crecimiento del virus. En este informe, también describimos un enfoque para generar rotavirus recombinantes que expresan una proteína de reportero fluorescente separada a través de la introducción de un elemento de parada-reinicio traslacional 2A en el segmento 7 del genoma (NSP3). Este enfoque evita eliminar o modificar cualquiera de los marcos de lectura abiertos virales, permitiendo así la producción de rotavirus recombinantes que retienen proteínas virales totalmente funcionales mientras expresan una proteína fluorescente.
Introducción
Los rotavirus son las principales causas de gastroenteritis grave en lactantes y niños pequeños, así como en los jóvenes de muchas otras especies de mamíferos y aves1. Como miembros de la familia Reoviridae, los rotavirus tienen un genoma segmentado de ARN de doble cadena (dsRNA). Los segmentos del genoma están contenidos dentro de un virión icosahedral no envuelto formado a partir de tres capas concéntricas de proteína2. Sobre la base de la secuenciación y el análisis filogenético de los segmentos del genoma, se han definido nueve especies de rotavirus (A-D, F-J)3. Esas cepas que compren....
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Protocolo
1. Preparación de medios y mantenimiento del cultivo celular
- Obtenga células renales de hámster bebé que expresen constitutivamente las células MA104 del ARN t7 (BHK-T7) y del riñón de mono verde africano.
NOTA: Las células BHK-T7 (o BSR-T7) no están disponibles comercialmente, pero son una línea celular común de laboratorios que utilizan genética inversa para estudiar la biología del virus del ARN. La línea celular BHK-T7 utilizada en este protocolo fue obtenida de la Dra. Ursula J. Buchholz (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, USA), co-desarrolladorde la línea celular BHK original que expresa T7 RNA polimerasa29. Las ce....
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Resultados
El protocolo de genética inversa descrito en este artículo se lleva a cabo a través de múltiples pasos distintos: (1) co-transfección de células BHK-T7 con vectores de transcripción de rotavirus pT7 y un plásmido de expresión pCMV/NP868R, (2) la sustitución de células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, (3) amplificación de virus recombinantes presentes en las células BHK-T7/MA104 se lisia utilizando células MA104 y (4) el aislamiento de la placa del virus recombinante utilizando células MA104(.......
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Discusión
En nuestro laboratorio, nos basamos rutinariamente en el protocolo de genética inversa descrito aquí para producir rotavirus SA11 recombinantes. Con este enfoque, las personas con poca experiencia en técnicas de biología molecular o el trabajo con rotavirus recuperan virus recombinantes incluso en su primer intento. Hemos generado cerca de 100 virus recombinantes siguiendo este protocolo, incluidos aquellos con genomas que han sido rediseñados para expresar proteínas extrañas (por ejemplo, FPs) y que contienen adiciones .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones De NIH R03 AI131072 y R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, y el Lawrence M. Blatt Endowment. Agradecemos a los miembros del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, y Guido Papa por sus muchas contribuciones y sugerencias en el desarrollo del protocolo de genética inversa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Riñón de hámster bebé - T7 RdRP (BHK-T7) Células | Contacto: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Poliacrilamida Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Celómetro AutoT4 Contador de células viables | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Sistema de imagen en gel | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP 194002 | ||
| Clarity Western Quimioluminiscencia Mejorada (ECL) Sustrato | Bio-Rad | 170-5060 | |
| E.coli competente DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Inhibidor completo de la proteasa | Pierce | A32965 | |
| Pipetas de transferencia desechables, puntas extendidas ultrafinas | MTC Bio | P4113-11 | |
| Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Calidad Biológica | 115-073-101 | |
| Etanol, Absoluto (200 pruebas) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Suero Fetal Bovino (FBS), Inactivado por Calor | Corning | 35-011-CV | |
| Bandera M2 Anticuerpo, Monoclonal de Ratón | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM con bajo fondo fluorescencia |
| Glasgow Medio esencial mínimo (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| IgG anti-conejo de cabra, peroxidasa de rábano picante (HRP) | Tecnología de señalización celular | 7074S Conejillo de | |
| Indias Anti-NSP3 Antisuero | Patton | 55068 | |
| conejillo de indias Anti-VP6 Antierum | Patton | 53963 | |
| IgG anti-conejillo de indias para caballos, peroxidasa de rábano picante (HRP) KPL conjugada | 5220-0366 | ||
| IgG anti-ratón para caballos, tecnología de señalización celular conjugada con eroxidasa de rábano picante (HRP) | 7076S | ||
| iNtRON Biotechnology e-Myco Myco Kit de detección de PCR | JH Science | 25235 | |
| Alcohol isopropílico | Macron | 3032-02 | |
| Solución de L-glutamina ( 100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Polvo (Miller's LB Agar) | Productos de investigación RPI | L24020-2000.0 | |
| Medio 199 (M199) Medio de cultivo | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Mínimo Medio esencial -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Riñón de mono (MA104) Células | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| Espectrofotómetro NanoDrop One | ThermoScientific | ||
| Solución Roja Neutra (0,33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Solución de aminoácidos no esenciales (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Poliacrilamida Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Agua de grado de biología molecular libre de nucleasas | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel y kit de limpieza de PCR | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Medio de suero reducido | Gibco | 31985-070 | |
| Mortero de pellets (sin RNasa, desechable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Fosfato solución salina tamponada (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Tripsina porcina, tipo IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| Sistema de minipreparación de plásmido PureYield | Promega | A1223 | |
| Qiagen Kit Maxi de plásmido | Qiagen Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Kit Midi de plásmido | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Vectores de transcripción | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Vectores de transcripción que expresan proteínas fluorescentes | Contacto: jtpatton@iu.edu | ||
| de placaKit RT-PCR de un solo paso Superscript | III Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Kit de transferencia de nitrocelulosa | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Sistema de transferencia Trans-Llot Turbo | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Reactivo de transfección | Mirus MIR2306 | ||
| Tampón de ejecución de gel Tris-Glycine-SDS (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreactivos | BP151-500 | |
| Trizol Reactivo de extracción de ARN | Ambion | 15596026 | |
| Azul | tripán Corning | 25-900-CI | |
| Tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) Solución de disociación celular | Calidad Biológico | 118-087-721 | |
| Caldo de fosfato de triptosa | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvente | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Generador de imágenes fluorescente de células vivas | Bio-Rad |
Referencias
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
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Reimpresiones y permisos
