Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor
Summary
Plazmid DNA’sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.
Abstract
Rotavirüsler, insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli ve kuş konak türlerinin genç şiddetli gastroenterit neden segmentli çift iplikli RNA virüslerin büyük ve gelişen bir nüfustur. Rotavirüs ters genetik sistemlerinin son gelişiyle, rotavirüs biyolojisini keşfetmek, mevcut rotavirüs aşılarını değiştirmek ve optimize etmek ve rotavirüs çok hedefli aşı vektörlerini geliştirmek için yönlendirilmiş mutagenezi kullanmak mümkün hale gelmiştir. Bu raporda, rekombinant rotavirüslerin etkin ve güvenilir bir şekilde geri kazanılmasına olanak tanıyan basitleştirilmiş bir ters genetik sistemini tanımlıyoruz. Sistem, tam uzunlukta rotavirüs (+)RNA’ları ve bir RNA kapama enzimini BHK hücrelerine kodlayan bir CMV vektörünü ifade eden T7 transkripsiyon vektörlerinin eş transfeksiyonuna dayanmaktadır. Rekombinant rotavirüsler MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücreleri overseeding tarafından yükseltilir, virüs büyümesi için son derece müsamahakar bir maymun böbrek hücre hattı. Bu raporda, genom segment7 ‘ye (NSP3) 2A çevirisel stop-restart elementi girişi yoluyla ayrı bir floresan muhabir proteini ifade eden rekombinant rotavirüsler imal etme yaklaşımını da açıklıyoruz. Bu yaklaşım, viral açık okuma çerçevelerinin herhangi birini silerek veya değiştirmekten kaçınarak, floresan proteini ifade ederken tamamen işlevsel viral proteinleri koruyan rekombinant rotavirüslerin üretimine olanak sağlar.
Introduction
Rotavirüsler bebeklerde ve küçük çocuklarda şiddetli gastroenteritin başlıca nedenleri olduğu gibi, diğer birçok memeli ve kuştürününgenç 1. Reoviridae ailesinin üyeleri olarak, rotavirüsler parçalı çift iplikçikli RNA (dsRNA) genomuna sahiptir. Genom segmentleri, üç konsantrik protein katmanından oluşan zarfsız bir ikozahedral virion içinde bulunur2. Genom segmentlerinin dizilimi ve filogenetik analizine dayanarak dokuz rotavirüs türü (A−D, F−J)tanımlanmıştır 3. Rotavirüs türleri A oluşan bu suşları insan hastalığının büyük çoğunluğu sorumludur4. Son on yılda başlayan çocukluk çağı bağışıklama programlarına rotavirüs aşılarının getirilmesi, rotavirüs mortalitesi ve morbiditesinde önemli azalmalarla ilişkilidir. En önemlisi, rotavirüs e bağlı çocukluk ölümlerinin sayısı 2000 yılında yaklaşık 528.000’den 2016’da 128.500’e düşmüştür4,5. Rotavirüs aşıları virüsün canlı zayıflatılmış suşları formüle edilir, 2-3 doz yaş 6 ay tarafından çocuklara uygulanan ile. Insanlar ve diğer memeli türlerinde dolaşan genetik olarak çeşitli rotavirüs suşları çok sayıda, hızla mutagenez ve reassortment yoluyla gelişmek için yetenekleri ile birlikte, rotavirüslerin türleri çocuklara bulaştıran antijenik değişikliklere yol açabilir6,7,8. Bu tür değişiklikler mevcut aşıların etkinliğini zayıflatabilir, bunların değiştirilmesi veya değiştirilmesi gerektirebilir.
11 rotavirüs genom segmentinden herhangi birinin manipülasyonunu sağlayan tam plazmid tabanlı ters genetik sistemlerin geliştirilmesi ancak9. Bu sistemlerin kullanılabilirliği ile, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinmoleküler ayrıntılarını çözmek, anti-rotavirüs bileşikleri için geliştirilmiş yüksek işlemli tarama yöntemleri geliştirmek ve rotavirüs aşılarının potansiyel olarak daha etkili sınıfları oluşturmak mümkün hale gelmiştir. Rotavirüs replikasyonu sırasında, kapaklı viral (+)RNA’lar sadece viral proteinlerin sentezine rehberlik etmekle kalmıyor, aynı zamanda dsRNA genom segmentlerinin sentezi için şablon görevi de veriyor10,11. Bugüne kadar açıklanan tüm rotavirüs ters genetik sistemleri, rekombinant virüslerin kurtarılmasında kullanılan cDNA kaynaklı (+)RNA’ların kaynağı olarak Memeli hücre hatlarına T7 transkripsiyon vektörlerinin transfeksiyonuna dayanır9,12,13. Transkripsiyon vektörleri içinde, tam uzunlukta viral cDNA’lar, t7 promotörü ve aşağı akım hepatit delta virüsü (HDV) ribozyme arasında konumlandırılır, öyle ki viral (+)RNA’lar otantik 5′ ve 3′-termini içeren T7 RNA polimeraz ile sentezlenirler (Şekil 1A). Birinci nesil ters genetik sistemde, rekombinant virüsler t7 RNA polimeraz (BHK-T7) ile 11 T7 (pT7) transkripsiyon vektörü ifade eden bebek hamster böbrek hücrelerinin transfecting tarafından yapılmıştır, simian SA11 virüs suşu benzersiz bir (+)RNA sentezi yönlendiren her, ve üç CMV promotör sürücü ekspresyon plazmidler, bir kuş reovirus p10FAST füzyon proteini kodlama ve vaccinia virüsü D1R-D12L kapama enzim kompleksi iki kodlama alt birimleri9. Transfected BHK-T7 hücrelerinde üretilen rekombinant SA11 virüsleri MA104 hücreleri ile overseeding tarafından güçlendirilmiştir, rotavirüs büyümesi için izin veren bir hücre hattı. İlk nesil ters genetik sisteminin değiştirilmiş bir sürümü artık destek plazmids12kullandığı tarif edilmiştir. Bunun yerine, modifiye sistemi başarıyla 11 SA11 T7 transkripsiyon vektörleri ile BHK-T7 hücreleri transfecting tarafından rekombinant rotavirüsler üretir, uyarı ile viral fabrika (viroplazm) yapı taşları (nonstructural proteinler NSP2 ve NSP5) düzeyleri 3 kat diğer vektörler14,15daha yüksek eklenir . Ters genetik sisteminin modifiye versiyonları da rotavirüs16,,17insan KU ve Odelia suşlarının kurtarma destekleyen geliştirilmiştir . Rotavirüs genomu, VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21ve NSP522,23içine tanıtılan mutasyonlar ile bugüne kadar oluşturulan rekombinant virüsler ile, ters genetik tarafından manipülasyon için son derece münasip olduğunu. Şimdiye kadar üretilen en yararlı virüsler arasında floresan muhabir proteinleri ifade etmek için tasarlanmış olanlar (FS)9,12,21,24,25.
Bu yayında, laboratuvarımızda kullandığımız ters genetik sisteminin protokolünü sa11 rotavirüs rekombinant suşları üretmek için sağlıyoruz. Protokolümüzün temel özelliği BHK-T7 hücrelerinin 11 pT7 transkripsiyon vektörü (pT7/NSP2SA11 ve pT7/NSP5SA11 vektörlerinin 3x seviyelerini içerecek şekilde modifiye edilmiş) ve Afrika domuz ateşi virüsünü (ASFV) NP868 capping enzim21 (2 Şekil)kodlayan bir CMV ekspresyonu vektörü ile birlikte transfeksiyonudur. Elimizde, NP868R plazmid varlığı transfected BHK-T7 hücreleri ile rekombinant virüslerin yüksek titreüretimine yol açar. Bu yayında, pT7/NSP3SA11 plazmidini, sadece segment 7 protein ürünü NSP3’ü değil, aynı zamanda ayrı bir FP’yi ifade eden rekombinant virüslerin üretilebildiği şekilde modifiye etmek için bir protokol de salıyoruz. Bu bir FP ORF (Şekil 1B)24,26tarafından takip bir downstream 2A çeviri durdurma-yeniden başlatma elemanı içeren pT7/NSP3SA11 plazmid NSP3 açık okuma çerçevesi (ORF) yeniden mühendislik tarafından gerçekleştirilir . Bu yaklaşım sayesinde, çeşitli LP’leri ifade eden rekombinant rotavirüsler oluşturduk: UnaG (yeşil), mKate (uzak kırmızı), mRuby (kırmızı), TagBFP (mavi), CFP (siyan) ve YFP (sarı)24,27,28. Bu FP ifade eden rotavirüsler NSP3 ORF silmeden yapılır, böylece işleyen viral proteinlerin tam bir tamamlayıcı kodlamak için beklenen virüsler verimli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laboratuvarımızda, rekombinant SA11 rotavirüsleri üretmek için burada tanımlanan ters genetik protokolüne rutin olarak güveniyoruz. Bu yaklaşımla, moleküler biyoloji teknikleri konusunda çok az deneyimi olan veya rotavirüslerle çalışan bireyler ilk denemelerinde bile rekombinant virüsleri kurtarırlar. Bu protokolü takip eden 100’e yakın rekombinant virüs ürettik, yabancı proteinleri (örneğin, FP’leri) ifade etmek için yeniden tasarlanmış genomlara sahip olanlar ve dizi eklemeleri, silmeler ve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH’nin R03 AI131072 ve R21 AI144881, Indiana Üniversitesi Start-Up Finansmanı ve Lawrence M. Blatt Vakfı tarafından desteklenmiştir. IU Rotahoosier laboratuvarı üyelerine, Ulrich Desselberger’e ve Guido Papa’ya ters genetik protokolünün geliştirilmesine yaptıkları birçok katkı ve öneri için teşekkür ederiz.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
