Forenklet Reverse Genetics metode til at inddrive rekombinant rotavira udtrykke Reporter Proteiner
Summary
Generation af rekombinant rotavira fra plasmid DNA er et vigtigt redskab til undersøgelse af rotavirus replikation og patogenese, og udviklingen af rotavirus udtryk vektorer og vacciner. Heri beskriver vi en forenklet omvendt genetik tilgang til at generere rekombinant rotavira, herunder stammer, der udtrykker fluorescerende reporter proteiner.
Abstract
Rotavira er en stor og udviklende population af segmenterede dobbeltstrengede RNA-vira, der forårsager alvorlig gastroenteritis hos unge af mange pattedyr s- og fugleværtsarter, herunder mennesker. Med den nylige fremkomsten af rotavirus reverse genetik systemer, er det blevet muligt at bruge rettet mutagenese til at udforske rotavirus biologi, ændre og optimere eksisterende rotavirus vacciner, og udvikle rotavirus multitarget vaccine vektorer. I denne rapport beskriver vi et forenklet omvendt genetiksystem, der muliggør effektiv og pålidelig genopretning af rekombinant rotavira. Systemet er baseret på co-transfection af T7 transskription vektorer udtrykker fuld længde rotavirus (+) RNAs og en CMV vektor kodning en RNA capping enzym i BHK celler konstituerende producerer T7 RNA polymerase (BHK-T7). Rekombinant rotavira forstærkes ved at overså de transficerede BHK-T7-celler med MA104-celler, en abecellecellelinje, der er meget eftergivende for virusvækst. I denne rapport beskriver vi også en tilgang til generering af rekombinant rotavira, der udtrykker et separat fluorescerende reporterprotein gennem indførelsen af et 2A translationelt stop-restart element i genomsegment et (NSP3). Denne fremgangsmåde undgår at slette eller ændre nogen af de virale åbne læserammer, hvilket gør det muligt at producere rekombinant rotavira, der bevarer fuldt funktionelle virale proteiner, samtidig med at de udtrykker et fluorescerende protein.
Introduction
Rotavira er hovedårsagerne til svær gastroenteritis hos spædbørn og småbørn samt unge af mange andre pattedyrs- og fuglearter1. Som medlemmer af Reoviridae-familien har rotavira et segmenteret dobbeltstrenget RNA-genom (dsRNA). Genomsegmenterne er indeholdt i en ikke-tiltrukket icosahedral virion dannet af tre koncentriske lag protein2. Baseret på sekventering og fylogenetisk analyse af genomsegmenterne er ni arter af rotavirus (A-D, F−J) blevet defineret3. De stammer, der omfatter rotavirusarter A, er ansvarlige for langt størstedelen af sygdommen hos mennesker4. Indførelsen af rotavirus vacciner i barndommen immunisering programmer begynder i det sidste årti er korreleret med betydelige reduktioner i rotavirus dødelighed og sygelighed. Mest bemærkelsesværdigt er antallet af rotavirusrelaterede dødsfald blandt børn faldet fra ca. 528 000 i 2000 til 128.500 i 20164,5. Rotavirusvacciner er formuleret fra levende svækket virusstammer, idet 2 til 3 doser gives til børn i 6 måneders alderen. Det store antal genetisk forskelligartede rotavirusstammer, der cirkulerer hos mennesker og andre pattedyrarter, kombineret med deres evne til hurtigt at udvikle sig gennem mutagenese og reassortment, kan føre til antigene ændringer i de typer rotavira, der inficerer børn6,7,8. Sådanne ændringer kan underminere effekten af eksisterende vacciner, der kræver, at de udskiftes eller ændres.
Udviklingen af fuldt plasmidbaserede reverse genetics systemer, der muliggør manipulation af nogen af de 11 rotavirus genom segmenter blev først for nylig opnået9. Med tilgængeligheden af disse systemer, er det blevet muligt at optrævle molekylære detaljer af rotavirus replikation og patogenese, at udvikle forbedrede high-throughput screening metoder til anti-rotavirus forbindelser, og at skabe nye potentielt mere effektive klasser af rotavirus vacciner. Under rotavirus replikation, udjævnet viral (+)RNAs ikke kun guide syntesen af virale proteiner, men også tjene som skabeloner til syntese af afkom dsRNA genom segmenter10,11. Alle rotavirus reverse genetics systemer beskrevet til dato er afhængige af transfection af T7 transskription vektorer i pattedyr cellelinjer som en kilde til cDNA-afledte (+)RNAs anvendes til at inddrive rekombinant virus9,12,13. Inden for transskriptionsvektorerne er virale cDA’er i fuld længde placeret mellem en opstrøms T7-promotor og nedstrøms hepatitis deltavirus (HDV), således at virale (+)RNA’er syntetiseres af T7 RNA-polymerase, der indeholder autentiske 5′ og 3′-termini (Figur 1A). I den første generation af omvendt genetik system, rekombinant virus blev foretaget ved at transfecting baby hamster nyreceller udtrykke T7 RNA polymerase (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transskription vektorer, hver lede syntese af en unik (+) RNA af simian SA11 virus stamme, og tre CMV promotor-drev udtryk plasmider, en kodning af aviær reovirus p10FAST fusion protein og to kodning underenheder af vaccinia virus D1R-D12L capping enzym kompleks9. Rekombinant SA11 virus genereret i transfected BHK-T7 celler blev forstærket ved overseeding med MA104 celler, en cellelinje eftergivende for rotavirus vækst. En modificeret version af den første generation omvendt genetik system er blevet beskrevet, at ikke længere bruger støtte plasmider12. I stedet, det ændrede system med succes genererer rekombinant rotavira blot ved at transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transskription vektorer, med det forbehold, at vektorer for den virale fabrik (viroplasm) byggesten (ikke-strukturelle proteiner NSP2 og NSP5) er tilføjet på niveauer 3-fold højere end de andre vektorer14,15. Der er også udviklet modificerede versioner af det omvendte genetiksystem , som understøtter genvindingen af de menneskelige KU- og Odelia-stammer af rotavirus16,17. Rotavirusgenomet er bemærkelsesværdigt modtageligt for manipulation ved omvendt genetik, med rekombinant virus genereret til dato med mutationer indført i VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, og NSP522,23. Blandt de mest nyttige vira , der er genereret indtil videre , er dem , der er udviklet til at udtrykke fluorescerende reporterproteiner9,12,21,24,25.
I denne publikation, vi giver protokollen for den omvendte genetik system, som vi bruger i vores laboratorium til at generere rekombinant stammer af SA11 rotavirus. Det vigtigste element i vores protokol er co-transfection af BHK-T7 celler med 11 pT7 transskription vektorer (modificeret til at omfatte 3x niveauer af pT7/NSP2SA11 og pT7/NSP5SA11 vektorer) og en CMV udtryk vektor kodning af afrikansk svinepest virus (ASFV) NP868R capping enzym21 (Figur 2). I vores hænder fører tilstedeværelsen af NP868R plasmid til produktion af højere titers af rekombinant virus ved transfected BHK-T7 celler. I denne publikation, vi også give en protokol til ændring af pT7/NSP3SA11 plasmid sådan, at rekombinant virus kan genereres, der udtrykker ikke kun segmentet 7 protein produkt NSP3, men også en separat FP. Dette opnås ved at reengineeringn eNSP3 open reading frame (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid for at indeholde et downstream 2A translationelt stop-restart element efterfulgt af et FP ORF (Figur 1B)24,26. Gennem denne tilgang, har vi genereret rekombinant rotavira udtrykke forskellige FPs: UnaG (grøn), mKate (langt-rød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan), og YFP (gul)24,27,28. Disse FP-ekspreserende rotavira fremstilles uden at slette NSP3 ORF, hvilket giver virus, der forventes at kode et komplet supplement af fungerende virale proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vores laboratorium, vi rutinemæssigt stole på den omvendte genetik protokol beskrevet heri til at producere rekombinant SA11 rotavira. Med denne tilgang, personer med ringe erfaring i molekylær biologi teknikker eller arbejder med rotavira inddrive rekombinant virus selv på deres første forsøg. Vi har genereret tæt på 100 rekombinant virus efter denne protokol, herunder dem med genomer, der er blevet re-manipuleret til at udtrykke udenlandske proteiner (f.eks FPs), og som indeholder sekvens tilføjelser, sletni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R03 AI131072 og R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, og Lawrence M. Blatt Endowment. Vi takker medlemmerne af IU Rotahoosier-laboratoriet, Ulrich Desselberger og Guido Papa for deres mange bidrag og forslag til udvikling af den omvendte genetikprotokol.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
