Forenklet omvendt genetikk metode for å gjenopprette rekombinant rotavirus uttrykke reporter proteiner

Summary

Generering av rekombinant rotavirus fra plasmid DNA gir et viktig verktøy for studiet av rotavirusreplikasjon og patogenese, og utvikling av rotavirusuttrykksvektorer og vaksiner. Her beskriver vi en forenklet omvendt genetikk tilnærming for å generere rekombinant rotavirus, inkludert stammer som uttrykker fluorescerende reporter proteiner.

Abstract

Rotavirus er en stor og utviklende populasjon av segmenterte dobbeltstrandede RNA-virus som forårsaker alvorlig gastroenteritt hos unge av mange pattedyr og fugleiske vertsarter, inkludert mennesker. Med den nylige advent av rotavirus omvendt genetikk systemer, Det har blitt mulig å bruke rettet mutagenesis å utforske rotavirus biologi, endre og optimalisere eksisterende rotavirus vaksiner, og utvikle rotavirus multitarget vaksine vektorer. I denne rapporten beskriver vi et forenklet omvendt genetikksystem som gjør det mulig å effektiv og pålitelig gjenoppretting av rekombinant rotavirus. Systemet er basert på kotransfection av T7 transkripsjon vektorer uttrykker full lengde rotavirus (+)RNAs og en CMV vektor koding en RNA capping enzym i BHK celler konstitutivt produsere T7 RNA polymerase (BHK-T7). Rekombinant rotavirus forsterkes ved å overvåke de transinfiserte BHK-T7-cellene med MA104-celler, en apenyrecellelinje som er svært tillatt for virusvekst. I denne rapporten beskriver vi også en tilnærming for å generere rekombinant rotavirus som uttrykker et eget fluorescerende reporterprotein gjennom innføringen av et 2A translasjonell stop-restart-element i genomsegment 7 (NSP3). Denne tilnærmingen unngår å slette eller modifisere noen av de virale åpne leserammene, slik at produksjonen av rekombinant rotavirus som beholder fullt funksjonelle virale proteiner samtidig som de uttrykker et fluorescerende protein.

Introduction

Rotavirus er hovedårsakene til alvorlig gastroenteritt hos spedbarn og små barn, samt de unge av mange andre pattedyr og fuglearter¹. Som medlemmer av Reoviridae-familien har rotavirus et segmentert dobbeltstrandet RNA (dsRNA) genom. Genomsegmentene finnes i en ikke-omsluttet icosahedral virion dannet av tre konsentriske lag av protein². Basert på sekvensering og fylogenetisk analyse av genomsegmentene, er ni arter av rotavirus (A−D, F-J) definert³. Disse stammene bestående av rotavirus arter A er ansvarlig for det store flertallet av menneskelig sykdom⁴. Innføringen av rotavirusvaksiner i barnevaksinasjonsprogrammer som begynner i det siste tiåret, er korrelert med betydelige reduksjoner i rotavirusdødelighet og sykelighet. Spesielt har antall rotavirus-tilknyttede barnedødsfall gått ned fra ca. 528 000 i 2000 til 128 500 i 2016^4,5. Rotavirusvaksiner er formulert fra levende attenuerte stammer av viruset, med 2 til 3 doser administrert til barn med 6 måneders alder. Det store antallet genetisk varierte rotavirusstammer som sirkulerer hos mennesker og andre pattedyrarter, kombinert med deres evne til raskt å utvikle seg gjennom mutagenesis og reassortment, kan føre til antigene endringer i typer rotavirus som smitter barn^6,7,8. Slike endringer kan undergrave effekten av eksisterende vaksiner, som krever erstatning eller modifikasjon.

Utviklingen av fullt plasmidbaserte revers genetikk systemer slik at manipulering av noen av de 11 rotavirus genom segmenter ble bare nylig oppnådd⁹. Med tilgjengeligheten av disse systemene har det blitt mulig å avdekke molekylære detaljer om rotavirusreplikasjon og patogenese, for å utvikle forbedrede screeningmetoder for høy gjennomstrømning for antirotavirusforbindelser, og for å skape nye potensielt mer effektive klasser av rotavirusvaksiner. Under rotavirus replikering, avkortet viral (+)RNAs ikke bare veilede syntesen av virale proteiner, men også tjene som maler for syntese av avkom dsRNA genom segmenter^10,11. Alle rotavirus omvendt genetikk systemer beskrevet til dags dato stole på transfection av T7 transkripsjon vektorer i pattedyr celle linjer som en kilde til cDNA-avledet (+)RNAs brukes i å gjenopprette rekombinant virus^9,12,13. Innenfor transkripsjonsvektorene er virale cDNAer i full lengde plassert mellom en oppstrøms T7-promoter og nedstrøms hepatitt deltavirus (HDV) ribozyme slik at virale (+)RNAer syntetiseres av T7 RNA polymerase som inneholder autentisk 5′ og 3′-termini (figur 1A). I første generasjons omvendt genetikk system, rekombinant virus ble gjort ved å transfecting baby hamster nyreceller uttrykker T7 RNA polymerase (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transkripsjon vektorer, hver reketisering av en unik (+)RNA av simian SA11 virus stamme, og tre CMV promotor-stasjonen uttrykk plasmids, en koding avian reovirus p10FAST fusjon protein og to koding underenheter av vaccinia virus D1R-D12L capping enzym kompleks⁹. Rekombinant SA11 virus generert i transfected BHK-T7 celler ble forsterket ved å overvåke med MA104 celler, en cellelinje tillatt for rotavirus vekst. En modifisert versjon av første generasjons omvendt genetikk system har blitt beskrevet som ikke lenger bruker støtte plasmids¹². I stedet genererer det modifiserte systemet rekombinant rotavirus ganske enkelt ved å transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transkripsjon vektorer, med forbehold om at vektorer for viral fabrikken (viroplasm) byggeblokker (ikke-strukturelle proteiner NSP2 og NSP5) legges til på nivåer 3 ganger høyere enn de andre vektorer^14,15. Modifiserte versjoner av det omvendte genetikksystemet er også utviklet som støtter utvinning av den menneskelige KU og Odelia stammer av rotavirus^16,17. Rotavirusgenomet er bemerkelsesverdig mottagelig for manipulering av omvendt genetikk, med rekombinantvirus generert til dags dato med mutasjoner introdusert i VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21, og NSP5^22,23. Blant de mest nyttige virusgenerert så langt er de som har blitt utviklet for å uttrykke fluorescerende reporter proteiner (FPs)^{9,12,21,24,25}.

I denne publikasjonen gir vi protokollen for det omvendte genetikksystemet som vi bruker i laboratoriet vårt for å generere rekombinante stammer av SA11 rotavirus. Nøkkelfunksjonen i vår protokoll er co-transfection av BHK-T7 celler med 11 pT7 transkripsjon vektorer (modifisert til å inkludere 3x nivåer av pT7/NSP2SA11 og pT7/NSP5SA11 vektorer) og en CMV uttrykk vektor koding afrikanske svinefeber virus (ASFV) NP868R capping enzym²¹ (Figur 2). I våre hender fører tilstedeværelsen av NP868R plasmid til produksjon av høyere titers av rekombinantvirus av transinfiserte BHK-T7-celler. I denne publikasjonen gir vi også en protokoll for endring av pT7/NSP3SA11 plasmid slik at rekombinantvirus kan genereres som ikke bare uttrykker segment 7 proteinproduktet NSP3, men også en egen FP. Dette oppnås ved å re-engineering NSP3 åpen avlesningramme (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid å inneholde en nedstrøms 2A translational stop-restart element etterfulgt av en FP ORF (Figur 1B)^24,26. Gjennom denne tilnærmingen har vi generert rekombinant rotavirus som uttrykker ulike FPs: UnaG (grønn), mKate (langt rød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan) og YFP (gul)^24,27,28. Disse FP-uttrykkende rotavirusene er laget uten å slette NSP3 ORF, og dermed gi virus som forventes å kode et komplett komplement av fungerende virusproteiner.

Protocol

1. Vedlikehold av medieforberedelse og cellekultur Få baby hamster nyreceller konstitutivt uttrykker T7 RNA polymerase (BHK-T7) og afrikanske grønne ape nyre MA104 celler.MERK: BHK-T7 (eller BSR-T7) celler er ikke kommersielt tilgjengelige, men er en vanlig cellelinje av laboratorier som bruker omvendt genetikk for å studere RNA-virusbiologi. BHK-T7 cellelinjen som brukes i denne protokollen ble hentet fra Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), en medutvikler av den op…

Representative Results

Den omvendte genetikkprotokollen som er beskrevet i denne artikkelen, fortsetter gjennom flere forskjellige trinn: (1) co-transfection av BHK-T7-celler med rotavirus pT7 transkripsjonsvektorer og en pCMV/NP868R-uttrykkplasmid, (2) tilsyn med transinfiserte BHK-T7-celler med MA104-celler, (3) forsterkning av rekombinantvirus som finnes i BHK-T7/MA104-celler ved hjelp av MA104-celler, og (4) plakkisolering av rekombinantvirus ved bruk av MA104-celler (Figur 2). I våre hender er protokollen ef…

Discussion

I vårt laboratorium er vi rutinemessig avhengige av den omvendte genetikkprotokollen som er beskrevet her for å produsere rekombinant SA11 rotavirus. Med denne tilnærmingen gjenoppretter personer med liten erfaring i molekylærbiologiteknikker eller arbeider med rotavirus rekombinantvirus selv på deres første forsøk. Vi har generert nærmere 100 rekombinantvirus etter denne protokollen, inkludert de med genomer som har blitt re-konstruert for å uttrykke utenlandske proteiner (f.eks. FPs) og som inneholder sekvenst…

Materials

Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells			Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel	Bio-Rad	45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter	Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System	Bio-Rad
Chloroform	MP	194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate	Bio-Rad	170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria	Lucigen	60602-2
Complete Protease Inhibitor	Pierce	A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips	MTC Bio	P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)	Quality Biological	115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Corning	35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal	Sigma-Aldrich	F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit	Sigma	NA0200-1KT
Geneticin (G-418)	Invitrogen	10131-027
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)	Gibco	11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated	Cell-Signaling Technology	7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum	Patton lab	lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum	Patton lab	lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated	KPL	5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated	Cell-Signaling Technology	7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit	JH Science	25235
Isopropyl alcohol	Macron	3032-02
L-glutamine Solution (100x)	Gibco	25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)	RPI research products	L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium	Hyclone	Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)	Lonza	04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer	ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%)	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x)	Gibco	11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel	Invitrogen	XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water	Invitrogen	10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit	Takara	740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable)	Fisher	12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep)	Corning	30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x	Fisher Bioreagents	BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S	Sigma-Aldrich	T0303
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Qiagen Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
SA11 pT7 Transcription Vectors	Addgene	89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins			Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose	Lonza	50000	For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose	Lonza	50100	For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit	Invitrogen	12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit	Bio-Rad	170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System	Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent	Mirus	MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)	Bio-Rad	161-0772
Triton X 100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent	Ambion	15596026
Trypan blue	Corning	25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution	Quality Biological	118-087-721
Tryptose Phosphate Broth	Gibco	18050-039
Tween-20	VWR	0777-1L
Vertrel VF solvent	Zoro	G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager	Bio-Rad