Förenklad reverse genetics metod för att återvinna rekombinanta Rotaviruses Expressing Reporter Proteiner
Summary
Generering av rekombinanta rotavirus från plasmid-DNA är ett viktigt verktyg för studier av rotavirusreplikation och patogenes samt utveckling av rotavirusuttrycksvektorer och vacciner. Häri beskriver vi en förenklad omvänd genetik metod för att generera rekombinanta rotaviruses, inklusive stammar som uttrycker fluorescerande reporter proteiner.
Abstract
Rotaviruses är en stor och föränderlig population av segmenterade dubbelsträngade RNA-virus som orsakar svår gastroenterit hos unga däggdjur och fågelvärden, inklusive människor. Med den senaste tidens tillkomst av rotavirus omvänd genetik system, har det blivit möjligt att använda riktade mutagenesis att utforska rotavirus biologi, ändra och optimera befintliga rotavirus vacciner, och utveckla rotavirus multitarget vaccin vektorer. I denna rapport beskriver vi ett förenklat omvänt genetiksystem som möjliggör effektiv och tillförlitlig återvinning av rekombinanta rotaviruses. Systemet är baserat på co-transfection av T7 transkriptionsvektorer som uttrycker fullängds rotavirus (+)RNAs och en CMV vektorkodning av ett RNA-takenzym till BHK-celler som utgör T7 RNA-polymeras (BHK-T7). Rekombinanta rotavirus förstärks genom att övervaka de transfected BHK-T7-cellerna med MA104-celler, en apa njurcelllinje som är mycket tillåtande för virustillväxt. I denna rapport beskriver vi också en metod för att generera rekombinanta rotavirus som uttrycker en separat fluorescerande reporter protein genom införandet av en 2A translationell stop-omstart element i arvsmassan segment 7 (NSP3). Detta tillvägagångssätt undviker att ta bort eller ändra någon av de virala öppna läsramarna, vilket möjliggör produktion av rekombinanta rotavirus som behåller fullt fungerande virusproteiner samtidigt som de uttrycker ett fluorescerande protein.
Introduction
Rotavirus är de främsta orsakerna till svår gastroenterit hos spädbarn och småbarn, liksom unga i många andra däggdjurs- och fågelarter1. Som medlemmar av Familjen Reoviridae har rotavirus en segmenterad dubbelsträngad RNA-genom (dsRNA). Arvsmassan segmenten finns i en icke-utvecklad icosahedral virion bildas från tre koncentriska lager av protein2. Baserat på sekvensering och fylogenetisk analys av genomsegmenten har nio arter av rotavirus (A−D, F−J) definierats3. De stammar som består av rotavirus art A är ansvariga för den stora majoriteten av mänskliga sjukdomar4. Införandet av rotavirus vacciner i barndomen immunisering program som börjar under det senaste decenniet är korrelerad med betydande minskningar av rotavirus dödlighet och sjuklighet. Framför allt har antalet dödsfall i rotavirusrelaterade barn minskat från cirka 528 000 år 2000 till 128 500 år 2016,,5.4 Rotavirusvacciner är formulerade från levande försvagade virusstammar, med 2 till 3 doser som administreras till barn vid 6 månaders ålder. Det stora antalet genetiskt olika rotavirus stammar som cirkulerar hos människor och andra däggdjur arter, i kombination med deras förmåga att snabbt utvecklas genom mutagenes och reassortment, kan leda till antigena förändringar i de typer av rotavirus infekterar barn6,7,8. Sådana förändringar kan undergräva effekten av befintliga vacciner och kräva att de ersätts eller modifieras.
Utvecklingen av helt plasmid-baserade omvänd genetik system som möjliggör manipulering av någon av de 11 rotavirus genomet segment uppnåddes förstnyligen 9. Med tillgången på dessa system har det blivit möjligt att reda ut molekylära detaljer om rotavirusreplikation och patogenes, att utveckla förbättrade screeningmetoder med hög genomströmning för anti-rotavirusföreningar och att skapa nya potentiellt effektivare klasser av rotavirusvacciner. Under rotavirusreplikation styr rna-rna inte bara syntesen av virusproteiner utan fungerar också som mallar för syntes av avkomman dsRNA-genomsegment10,11. Alla rotavirus omvänd genetik system som beskrivits hittills förlita sig på transfection av T7 transkription vektorer i däggdjurs cellinjer som en källa till cDNA-härledda (+)RNAs används för att återvinna rekombinanta virus9,12,13. Inom transkriptionsvektorerna placeras fullängds viruscDNAs mellan en uppströms T7-promotor och nedströms hepatitdelvirus (HDV) så att virus (+)RNAs syntetiseras av T7 RNA-polymeras som innehåller äkta 5′ och 3′-termini (figur 1A). I det första generationens omvänd genetiksystem gjordes rekombinanta virus genom att transfecting baby hamster njurceller uttrycker T7 RNA polymeras (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transkriptionsvektorer, varje regisyntes av ett unikt (+)RNA av simian SA11 virusstam, och tre CMV promotor-enhet uttryck plasmider, en kodning av aviära reovirus p10FAST fusion protein och två kodning underenheter vaccinia viruset D1R-D12L tak enzym komplex9. Rekombinanta SA11 virus som genereras i transfected BHK-T7 celler förstärktes genom att övervaka med MA104 celler, en cellinje tillåtande för rotavirus tillväxt. En modifierad version av det första generationens omvänd genetik system har beskrivits som inte längre använder stöd plasmider12. Istället genererar det modifierade systemet framgångsrikt rekombinanta rotavirus helt enkelt genom att transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transkription vektorer, med förbehållet att vektorer för viral fabrik (viroplasm) byggstenar (nonstructural proteiner NSP2 och NSP5) läggs till nivåer 3-faldig högre än de andra vektorerna14,15. Modifierade versioner av det omvända genetiksystemet har också utvecklats som stöder återvinning av mänskliga KU och Odelia stammar av rotavirus16,17. Rotavirusgenomet är anmärkningsvärt mottaglig för manipulation av omvänd genetik, med rekombinanta virus som genereras hittills med mutationer som införts i VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21och NSP522,23. Bland de mest användbara virus som genereras hittills är de som har konstruerats för att uttrycka fluorescerande reporter proteiner (FPs)9,12,21,24,25.
I denna publikation tillhandahåller vi protokollet för det omvända genetiksystemet som vi använder i vårt laboratorium för att generera rekombinanta stammar av SA11 rotavirus. Det viktigaste inslaget i vårt protokoll är samtransfekt av BHK-T7 celler med 11 pT7 transkription vektorer (ändras för att inkludera 3x nivåer av pT7/NSP2SA11 och pT7/NSP5SA11 vektorer) och en CMV uttryck vektor kodning den afrikanska svinpest-virus (ASFV) NP868R tak enzym21 (Figur 2). I våra händer leder närvaron av NP868R plasmid till produktion av högre titers av rekombinanta virus av transfected BHK-T7 celler. I denna publikation tillhandahåller vi också ett protokoll för att ändra pT7/NSP3SA11 plasmid så att rekombinanta virus kan genereras som uttrycker inte bara segmentet 7 proteinprodukt NSP3 men också en separat FP. Detta åstadkoms genom att re-engineering NSP3 öppen läsram (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid att innehålla en nedströms 2A translationell stop-omstart element följt av en FP ORF(Figur 1B)24,26. Genom detta tillvägagångssätt har vi genererat rekombinanta rotavirus som uttrycker olika FPs: UnaG (grön), mKate (långröd), mRuby (röd), TagBFP (blå), CFP (cyan) och YFP (gul)24,27,28. Dessa FP-uttrycker rotavirus görs utan att ta bort NSP3 ORF, vilket ger virus som förväntas koda ett komplett komplement av fungerande virala proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vårt laboratorium förlitar vi oss rutinmässigt på det omvända genetikprotokollet som beskrivs häri för att producera rekombinanta SA11 rotaviruses. Med detta tillvägagångssätt, individer med liten erfarenhet av molekylärbiologiska tekniker eller arbetar med rotavirus återhämta rekombinanta virus även på deras första försök. Vi har genererat nära 100 rekombinanta virus efter detta protokoll, inklusive de med genom som har omarbetats för att uttrycka främmande proteiner (t.ex. FPs) och som innehålle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R03 AI131072 och R21 AI144881, Indiana University Start-Up Finansiering, och Lawrence M. Blatt Endowment. Vi tackar medlemmar av IU Rotahoosier laboratoriet, Ulrich Desselberger, och Guido Papa för deras många bidrag och förslag för att utveckla omvänd genetik protokollet.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
