Électroporation in Utero de marqueurs multiaddressables intégrant la couleur du génome (MAGIC) pour individualiser les astrocytes corticals de souris

Summary

Les astrocytes tuent uniformément le cortex cérébral, rendant l’analyse de leur morphologie complexe difficile au niveau cellulaire. Le protocole fourni ici utilise l’étiquetage multicolore basé sur l’électroporation in utero pour étiqueter les astrocytes corticaux et analyser leur volume et leur morphologie avec un pipeline d’analyse d’image convivial.

Abstract

Les astrocytes protoplasmiques (PrA) situés dans le cortex cérébral de la souris sont étroitement juxtaposés, formant une matrice tridimensionnelle apparemment continue aux stades adultes. Jusqu’à présent, aucune stratégie d’immunostaining ne peut les entacher et segmenter leur morphologie chez les animaux matures et au cours de la corticogenèse. La PrA corticale provient d’progéniteurs situés dans le pallium dorsale et peut facilement être ciblée à l’aide de l’électroporation in utero des vecteurs intégrateurs. Un protocole est présenté ici pour étiqueter ces cellules avec la stratégie multiaddressable de marqueurs de couleur intégrant le génome (MAGIC), qui s’appuie sur la transposition piggyBac/Tol2 et la recombinaisonCre/lox pour exprimer stochastically des protéines fluorescentes distinctes (bleu, cyan, jaune et rouge) adressées à des compartiments subcellulaires spécifiques. Cette stratégie de cartographie du destin multicolore permet de marquer in situ les progéniteurs corticals à proximité avec des combinaisons de marqueurs de couleur avant le début de la gliogenèse et de suivre leurs descendants, y compris les astrocytes, des stades embryonnaires aux stades adultes au niveau cellulaire individuel. L’étiquetage semi-clairsemé obtenu en ajustant la concentration des vecteurs électroporés et des contrastes de couleurs fournis par les marqueurs de couleur multiaddressables intégrant le génome (marqueurs MAGIQUEs ou MM) permet d’individualiser les astrocytes et de étiqueter leur territoire et leur morphologie complexe malgré leur arrangement anatomique dense. Présenté ici est un workflow expérimental complet comprenant les détails de la procédure d’électroporation, l’acquisition de piles d’images multicanaux par microscopie confocale, et la segmentation tridimensionnelle assistée par ordinateur qui permettra à l’expérimentateur d’évaluer le volume et la morphologie individuels de PrA. En résumé, l’électroporation des marqueurs MAGIQUEs fournit une méthode pratique pour étiqueter individuellement de nombreux astrocytes et accéder à leurs caractéristiques anatomiques à différents stades de développement. Cette technique sera utile pour analyser les propriétés morphologiques corticales des astrocytes dans divers modèles muraux sans recourir à des croisements complexes avec des lignes de reporter transgéniques.

Introduction

Les astrocytes jouent de nombreuses fonctions vitales dans le développement du cerveau et la^{physiologie 1}. Outre leur rôle à la barrière hémono-encéphalique où ils régulent l’absorption des nutriments et le flux sanguin, ils contribuent activement à la formation et à la fonction de la synapse tout en produisant des neuromodulateurs qui peuvent modifier l’activité neuronale et le^{comportement 2}. En outre, le dysfonctionnement d’astrocyte contribue à une série de désordres neurologiques^3. Les astrocytes situés dans le cortex cérébral présentent une morphologie élaborée permettant un contact étendu avec les processus neuronaux. Ces contacts, essentiels à la fonction du circuit, contrôlent également la morphogenèse et la synaptogenèse des astrocytes par le biais de protéines d’adhérence^{cellulaire 4}. Les neuroscientifiques ont besoin d’outils pratiques et robustes pour étudier le développement des astrocytes et la morphogenèse dans leurs modèles neurologiques d’intérêt. Cependant, en raison de l’apposition étroite des astrocytes à leurs voisins et de leur carrelage tridimensionnel uniforme, il est difficile d’étiquetant les astrocytes corticaux et d’évaluer globalement leur morphologie à l’aide d’immunomarqueurs.

Actuellement, deux stratégies principales de génie génétique permettent l’étiquetage et l’individualisation des astrocytes corticals in situ : l’activation clairsemée de journaliste dans les lignes transgéniques de souris ou la transgenèse somatique utilisant l’électroporation des plasmides de journaliste. La première stratégie repose sur l’élevage d’une ligne de souris reporter floxed avec des souris exprimant une forme inductible de Cre recombinase activé spécifiquement dans les astrocytes lors de la livraison de tamoxifène (par exemple, Aldh1l1-CreERT2⁵). Plusieurs inconvénients sont associés à cette stratégie. Tout d’abord, la reproduction de souris transgéniques nécessite un grand nombre d’animaux et de multiples analyses sont généralement nécessaires pour déterminer la bonne dose de tamoxifène pour fournir une étiquetage suffisamment clairsemée des astrocytes corticals. L’analyse des phénotypes corticals d’astrocyte dans un modèle génétique de souris d’intérêt exigera encore plus d’élevage et de consommation de souris. En outre, l’injection in utero tamoxifène est connue pour interférer avec la parturition, ce qui rend cette stratégie difficile à appliquer à l’étude des premiers stades du développement des astrocytes. L’électroporation in vivo de l’ADN est une stratégie alternative sans tamoxifène qui repose sur un nombre minimum d’animaux⁶. Réalisée à des stades embryonnaires ou postnatals, cette approche consiste à injecter des plasmides reporter dans les ventricules latéraux des rongeurs suivis d’impulsions électriques qui créent des pores dans la membrane cellulaire, permettant ainsi à l’ADN d’entrer dans les cellules progénitrices tapissant le ventricule. Par la suite, les transgènes reporter transportés par les plasmides électroporés sont traités par les machines cellulaires ciblées et^{exprimés 7}. Deux méthodes d’électroporation ont été précédemment décrites pour étiqueter les astrocytes corticals de souris : 1) étiquetage postnatal d’astrocyte par électroporation (PALE), qui s’appuie sur l’électroporation des plasmides épisomal monocolores de reporter de 1-2 aux étapes postnatales^{tôt 4}; 2) La stratégie StarTrack basée sur l’électroporation in utero (IUE) de plusieurs plasmides reporter intégrateur monocolore^8,9,10. Bien que ces deux techniques étiquettent efficacement la PrA dans le cortex cérébral, elles présentent également certaines limitations. Dans leur version initiale, les deux méthodes s’appuient sur un promoteur glial de protéine acide fibrillaire (GFAP) pour conduire l’expression dans les astrocytes, qui peuvent biaiser l’étiquetage vers les gliales radiales aussi bien que les astrocytes piaux et réactifs qui expriment GFAP plus fortement que pra de repos normal^11,12. En ce qui concerne pale, d’autres inconvénients sont le stade tardif de l’électroporation, qui empêche l’étiquetage de prA tôt-né (ou ceux provenant des progéniteurs délaminating tôt) et l’analyse des premiers stades du développement d’astroglia, et l’utilisation des vecteurs épisomal qui deviennent dilués par des divisions successives pendant la prolifération massive que PrA subissent pendant la première semaine postnatale^13,14. Contrairement à PALE, StarTrack est basé sur l’électroporation embryonnaire des plasmides de reporter intégratifs qui permettent de suivre la contribution des progéniteurs embryonnaires et postnatals à la PrA. Un système StarTrack mis à jour en s’appuyant sur le promoteur ubiquitine C (UbC-StarTrack) réalise une expression plus large des reporters fluorescents dans la descente neuronale et gliaë (astrocytes inclus) des progéniteurs neuronaux^15,16,17. Toutefois, dans sa version actuelle, la mise en œuvre de cette approche est complexe, car elle repose sur un mélange équimolaire de 12 plasmides distincts exprimant six protéines fluorescentes (FP) avec excitation partielle et chevauchement des spectres d’émission.

Présenté ici est une simple méthode d’étiquetage multicolore à base d’électroporation utero en utilisant des constructions de journaliste intégrateur conduit par un promoteur fort et largement actif pour étiqueter les astrocytes corticals¹⁴. En outre, un pipeline facile d’analyse d’image utilisant des logiciels d’analyse d’image sous licence (p. ex., Imaris) et en libre accès (Vaa3D^18,19,20)est fourni pour segmenter le volume territorial et l’arborisation des astrocytes, respectivement. Par rapport aux méthodes décrites précédemment, cette stratégie repose uniquement sur 1-2 transgènes intégratifs multicolores Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers ou MM²¹) dirigés vers le compartiment cytoplasmique et (en option) des cellules nucléaires dont l’expression est pilotée par un promoteur synthétique du CAG composé d’un exhausteur de cytomégalovirus, d’un promoteur de β-actine de poulet et d’un site d’accepteur d’épissage de β-globine^{de lapin 22}. Cela permet l’étiquetage et le suivi des astrocytes corticals, des stades postnatals embryonnaires aux stades postnatals tardifs, indépendamment de l’expression^{GFAP 14,23}. Chacun de ces transgènes porte les quatre FP distincts suivants : eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP et tdTomato/mCherry, qui présentent un chevauchement spectral minimal qui peut être facilement contourné avec 1) l’acquisition séquentielle de canaux; 2) Puissance d’excitation optimisée et gain de collection ; et 3) Filtres dichroïques spécifiques pour recueillir les fenêtres d’émission fp étroites. La stratégie MM utilise la recombinaisonCre/lox avec une recombinase cre auto-excisable (seCre) pour stimuler l’expression stochastique de fp dans une population cellulaire. Une seule copie de MM transgene exprime FP d’une manière mutuellement exclusive, tandis que plusieurs transgènes donnent lieu à des combinaisons FP, créant des dizaines de teintes distinctes. L’intégration génomique des transgènes est entraînée par le système de transposition piggyBac (PB) ou Tol2^24,25,26. Par conséquent, grâce à l’électroporation in utero, la boîte à outils MM et la « mosaïque » multicolore qu’elle génère permettent le marquage simultané de plusieurs progéniteurs corticals adjacents et le suivi de leur descente gliale, y compris les astrocytes corticals, sur de longues périodes. Les contrastes de couleurs résultant de l’expression d’un FP distinct permettent de délimiter le contour de la PrA et d’extraire par la suite des informations clés sur leur volume territorial (à l’aide de l’IMARIS) et leur morphologie complexe (à l’aide de Vaa3D). La stratégie multicolore présentée en détail ici est une méthode pratique et robuste qui donne un accès rapide et facile à la surface corticale des astrocytes et à la morphologie chez les souris de type sauvage à différents stades de développement, et est facilement adaptable pour étudier les caractéristiques anatomiques des astrocytes dans les modèles muraux de maladies neurologiques sans utiliser de lignes de reporter transgéniques.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites ici ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles. Les protocoles animaux ont été approuvés par le Conseil d’éthique de l’expérimentation animale de Charles Darwin (CEEACD/N°5). 1. Préparation de plasmides sans endotoxine pour marqueurs MAGIQUEs dans l’électroporation utero Transformation bactérienne Sur la glace, décongeler les cellules dh5 alpha compétentes stockées à -70 °C. Ré…

Representative Results

L’électroporation des marqueurs MAGIQUEs chez les progéniteurs corticals embryonnaires permet l’étiquetage des astrocytes des stades précoces à avancés du développement du cortex cérébral (figure 1). Ces astrocytes ont été trouvés dans toutes les couches corticales à divers stades postnatals (P4, P7, P21) car ils se sont dispersés largement dans le cortex cérébral entier. Ils ont été évalués à l’aide d’images confoccales carrelées acquises avec un objectif de 20…

Discussion

L’électroporation in utero (IUE) des marqueurs MAGIQUEs chez les progéniteurs corticals (figure 1) a permis l’étiquetage des astrocytes dans tout le cortex cérébral postnatal à différents stades postnatals (P4-P7-P21, figure 2). Fait intéressant, le stade de l’IUE n’est pas critique, car l’électroporation effectuée de E13.5 à E15.5 donne des modèles d’étiquetage similaires concernant les astrocytes corticals¹⁴. Ce…

Materials

1.1 Bacteria transformation
Ampicillin	Euromedex	EU0400-C
DH5 alpha competent cells	Fisher Scientitic	11563117
Ice box	Dutscher	139959
Kanamycin	Sigma	60615
LB Agar	Sigma	L2897
SOC medium	Fisher Scientitic	11563117
Sterile petri dish- 10 cm	Thermo Fisher	150350
Water bath	VWR	462-0556H
1.2 Plasmid culture
14 ml culture tube	Dutscher	187262
Glass erlenmeyer- 2L	Fisher Scientitic	11383454
LB medium	Sigma	L3522
1.3 Plasmid DNA preparation
NucleoBond Xtra Maxi Plus EF	Macherey-Nagel	740426.10
2.1 Preparation of the solutions
26 G x 1/2 needle	Terumo	8AN2613R1
30 G x 1/2 needle	Terumo	8AN3013R1
Fast Green	Sigma Aldrich	F7272
NaCl	VWR	27810.295
Single-use polypropylene syringe, 1 mL	Dutscher	50002
2.2 Preparation of the surgery material
Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm	FST	11617-12
Arched tip Forceps- 10 cm	FST	11071-10
Glass bead sterilizer Steri 250	Sigma	Z378569
Glass micropipette 1 mm diameter	FHC	10-10-L
Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm	FST	11651-10
Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm	FST	11650-10
Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm	FST	14060-09
Laboratory tape	Fisher Scientitic	11730454
Microinjector	INJECT+MATIC	No catalog number
Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm	FST	12002-12
Optical fiber	VWR	631-1806
Plastic-coated white paper	Distrimed	700103
Signagel electrode gel	Free-Med	15-60
Sterile Petri dish- 35 mm	Dutscher	056714
Sterilizer, glass dry bead, Steri 250	Sigma	Z378569
2.3 Preparation of the pregnant female mouse
Alcohol pad	Alcomed	1731000
Buprecare	Axience	0.3 mg/ml
Compress	tRAFFIN	70189
Ketamine	Merial	Imalgene 1000
Ocular gel	tvm lab	Ocry-gel
RjOrl:SWISS mice	Janvier Labs
Vetadine, 10% solution	Vetoquinol	4337400113B
Warming pad	Harvard Apparatus	72-0493
Xylazine	Bayer	Rompun 2%
3.2 Electroporation
Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse	Novosyn	C0068220
Electroporateur Sonidel	Sonidel	NEPA 21
Sterile transfer pipets (individually wrapped)	Dutscher	043202S
Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes	Sonidel	CUY650P3
4.1 Tissue harvesting and sectioning
24-well plate	Falcon	353047
Agarose	Lonza	50004
Antigenfix	Microm Microtech	U/P0014
Coverslip	Dutscher	100266
Dolethal	Vetoquinol	DOL202
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	11540486
Nail polish	EMS	72180
Slide	Dutscher	100001
Vectashield	Vectorlabs	H-1000
Vibratome	Leica	VT1000S
5. Multichannel confocal imaging
20X oil NA 0.85	Olympus
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM880
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1000
Plan Apochromat 20x/0.8 M27	Carl Zeiss
6. Astrocyte territorial volume segmentation
IMARIS 8.3 and later versions	Bitplane
7. Astrocyte arborization tracing
3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D)	HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science