В Utero Electroporation multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Маркеры для индивидуализации кортикальной мыши астроцитов
Summary
Астроциты плитки коры головного мозга равномерно, что делает анализ их сложной морфологии сложной на клеточном уровне. Протокол, представленный здесь, использует многоцветную маркировку на основе электропорации матки, чтобы выделить корковые астроциты и проанализировать их объем и морфологию с помощью удобного конвейера анализа изображений.
Abstract
Протоплазмические астроциты (PrA), расположенные в коре головного мозга мыши, плотно сопоставляются, образуя явно непрерывную трехмерную матрицу на взрослых стадиях. До сих пор никакая стратегия иммуностимации не может выделить их и сегментировать их морфологию у зрелых животных и в течение кортикогенеза. Кортикальный PrA происходит от прародителей, расположенных в спинном паллиуме и может быть легко направлены с помощью внутриутробного электропорации интегративных векторов. Протокол представлен здесь, чтобы обозначить эти клетки с мультиадресурсной генома интеграции цвета (MAGIC) Маркеры стратегии, которая опирается на piggyBac/Tol2 транспозиции и Cre /Lox рекомбинации стохастично выразить различные флуоресцентные белки (синий, голубой, желтый и красный), адресованные конкретных подклеточных отсеков. Эта многоцветная стратегия картирования судьбы позволяет отметить на месте близлежащих корниковых прародителей с комбинациями цветовых маркеров до начала глиогенеза и отслеживать их потомков, в том числе астроцитов, от эмбриональных до взрослых стадий на индивидуальном клеточном уровне. Полу-разреженная маркировка, достигнутая путем корректировки концентрации электропомерных векторов и цветовых контрастов, предоставляемых Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers или MM), позволяет индивидуализировать астроциты и выделить их территорию и сложную морфологию, несмотря на их плотное анатомическое расположение. Здесь представлен комплексный экспериментальный рабочий процесс, включающий детали процедуры электропорации, многоканальные стеки изображений, приобретение конфокальной микроскопии, а также трехмерную сегментацию с помощью компьютера, которая позволит экспериментатору оценить индивидуальный объем PrA и морфологию. Таким образом, электропорация маркеров MAGIC обеспечивает удобный метод индивидуальной маркировки многочисленных астроцитов и получения доступа к их анатомическим особенностям на различных стадиях развития. Этот метод будет полезен для анализа корковых астроцитов морфологических свойств в различных моделях мыши, не прибегая к сложным крестам с трансгенными линиями репортера.
Introduction
Астроциты играют многочисленные жизненно важные функции в развитии мозга и физиологии1. Помимо своей роли в гемово-мозговой барьер, где они регулируют поглощение питательных веществ и кровоток, они активно способствуют формированию синапса и функции при производстве нейромодуляторов, которые могут изменить нейроннойактивности и поведения 2. Кроме того, дисфункция астроцитов способствует различным неврологическим расстройствам3. Астроциты, расположенные в коре головного мозга, демонстрируют сложную морфологию, позволяющую широко контактировать с нейронными процессами. Эти контакты, необходимые для функции цепи, также контролируют морфогенез астроцитов и синаптогенез через белки клеточной адгезии4. Нейробиологам нужны удобные и надежные инструменты для исследования развития астроцитов и морфогенеза в их неврологических моделях, представляющих интерес. Однако, из-за близкого аппозиции астроцитов к своим соседям и их равномерной трехмерной плитки, это сложно выделить корковых астроцитов и всесторонне оценить их морфологии с помощью иммуномаркеров.
В настоящее время две основные стратегии генной инженерии позволяют маркировать и индивидуализировать кортикальные астроциты на месте: разреженная активация репортера в трансгенных линиях мыши или соматический трансгенез с использованием электропорации плазмидов репортера. Первая стратегия опирается на разведение floxed репортер мыши линии с мышами, выражают неопровержимую форму Cre рекомбиназы активируется специально в астроцитов при доставке тамоксифена (например, Aldh1l1-CreERT25). С этой стратегией связано несколько недостатков. Во-первых, разведение трансгенных мышей требует большого количества животных и несколько анализов, как правило, необходимы для определения надлежащей дозы тамоксифена, чтобы обеспечить адекватно разреженную маркировку корковых астроцитов. Анализ фенотипов корковой астроцитов в модели генетической мыши, представляющих интерес, потребует еще большего размножения и потребления мышей. Кроме того, в утробе матери тамоксифен инъекции, как известно, вмешиваться в parturition, что делает эту стратегию трудно применять к изучению ранних стадиях развития астроцитов. Электропорация ДНК In vivo является альтернативной стратегией, свободной от тамоксифена, которая опирается на минимальное количество животных6. Выполненный либо на эмбриональных или послеродовых стадиях, этот подход состоит из инъекций плазмидов репортера в боковой желудочков грызунов следуют электрические импульсы, которые создают поры в клеточной мембране, что позволяет ДНК войти в клетки-предшественники, выстилающие желудочек. Впоследствии, репортер трансгены осуществляется электропотерированных плазмидов обрабатываются целевой клеточной техники и выразил7. Два метода электропорации были ранее описаны для обозначения корковой астроцитов мыши: 1) Постнатальная астроцитная маркировка электропорацией (PALE), которая опирается на электропорацию 1-2 одноцветных плазмид эписомальных репортеров на ранних послеродовыхстадиях 4; 2) Стратегия StarTrack основана на утеро-электропорации (IUE) нескольких одноцветных интегративныхплазмиды репортера 8,9,10. Хотя эти два метода эффективно этикетки PrA в коре головного мозга, они также представляют некоторые ограничения. В своей первоначальной версии, оба метода полагаются на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) промоутер диск выражение в астроцитов, которые могут смещения маркировки к радиальной глии, а также pial и реактивных астроцитов, которые выражают GFAP сильнее, чем нормальный отдых PrA11,12. Что касается PALE, другие недостатки поздней стадии электропорации, которая предотвращает маркировку раннерожденных PrA (или тех, которые возникают из ранних delaminating прародителей) и анализ ранних стадиях развития астроглии, и использование эписомальных векторов, которые становятся разбавленных через последовательные деления во время массовогораспространения,что PrA пройти в течение первой послеродовой недели13,14. В отличие от PALE, StarTrack основан на эмбриональной электропорации интегративных плазмидов репортера, которые позволяют отслеживать вклад эмбриональных и постнатальных прародителей в PrA. Обновленная схема StarTrack, опираясь на промоутер ubiquitin C (UbC-StarTrack) достигает более широкого выражения флуоресцентных репортеров как в нейронном, так и в глианом спуске (астроциты включены) нейронных прародителей15,16,17. Однако в его нынешнем варианте реализация этого подхода является сложной, поскольку он опирается на эквимоляльную смесь из 12 различных плазмидов, выражаюющих шесть флуоресцентных белков (FP) с частичным возбуждением и спектрами выбросов.
Представлено здесь является простым в утробе матери электропорации основе многоцветной маркировки метод с использованием интегративных репортер конструкций обусловлен сильным и широко активным промоутер выделить корковых астроцитов14. Кроме того, легкий конвейер анализа изображений с использованием как лицензированного (например, Imaris), так и открытого доступа (Vaa3D18,19,20)программного обеспечения для анализа изображений предоставляется сегменту территориального объема астроцитов и арборизации, соответственно. По сравнению с ранее описанными методами, эта стратегия опирается исключительно на 1-2 многоцветных интегративных трансгенов Multiaddressable генома интеграции цветовых маркеров (MAGIC маркеры или ММ21) направлены на цитоплазмы и (по желанию) ядерного отсека ячейки, выражение которого определяется синтетическим CAG промоутер состоит изцитомегаловирусаусилитель, курица β-actin промоутер, и кролик β Это позволяет маркировать и отслеживать корковые астроциты, от эмбриональных до поздних постнатальных стадий, независимо от экспрессии GFAP14,23. Каждый из этих трансгенов несет следующие четыре различных FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP и tdTomato/mCherry, которые отображают минимальное спектральное перекрытие, которое можно легко обойти с приобретением 1) последовательного канала; 2) Оптимизированная сила возбуждения и увеличение сбора; и 3) Специфические дихроические фильтры для сбора узких окон выбросов FP. Стратегия MM используетрекомбинацию Cre/lox с самоизвестной рекомбиназой Cre (seCre) для привода стохастичного выражения FP в клеточной популяции. Одна копия MM transgene выражает FP взаимоисключающим образом, в то время как несколько трансгенов создают комбинации FP, создавая десятки различных оттенков. Геномная интеграция трансгенов определяется piggyBac (PB) или Tol2 транспозиционнойсистемы 24,25,26. Таким образом, через в утробе матери электропорации, инструментарий ММ и многоцветной “мозаики”, что он генерирует позволяют одновременной маркировки нескольких смежных корковых прародителей и отслеживания их глиального происхождения, в том числе корковых астроцитов, в течение длительных периодов времени. Цветовые контрасты, возникающие в результате выражения четкого FP разрешения разграничения контура PrA и последующего извлечения ключевой информации об их территориальном объеме (с использованием IMARIS) и сложной морфологии (с использованием Vaa3D). Многоцветная стратегия, представленная подробно здесь, является удобным и надежным методом, который дает быстрый и легкий доступ к поверхности корковой астроцитов и морфологии у мышей дикого типа на различных стадиях развития, и легко адаптируется для исследования анатомических особенностей астроцитов в мышиных моделях неврологических заболеваний без использования трансгенных линий репортера.
Protocol
Representative Results
Discussion
В утробе электропорации (IUE) маркеров MAGIC в корковых прародителей (Рисунок 1) включена маркировка астроцитов по всей послеродовой коры головного мозга на различных постнатальных стадиях (P4-P7-P21, Рисунок 2). Интересно, что стадия IUE не критична, так как электр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим S. Fouquet и изображения и животных основных объектов Института де ла Видение и Институт неврологии Монпелье (МРТ и оперативной памяти) за техническую помощь. Эта работа была поддержана стипендий от Региона Иль-де-Франс и Фонд АРК за Recherche сюр-ле-Рак для S.C, и от Университета Париж-Саклай (Инициативы Докторанты Interdisciplinaires) в Лос-Анджелесе, путем финансирования от Европейского научно-исследовательского совета (ERC-SG 336331, PI J. Valette) до E.H., Агентством Nationale de la Recherche по контрактам ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-E’PX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Франция) , Фондом за Recherche M’dicale (Ref. DBI20141231328), Европейским исследовательским советом (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) и программой ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).
