Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical
Summary
Os astrócitos ladrilho o córtex cerebral uniformemente, tornando a análise de sua morfologia complexa desafiadora a nível celular. O protocolo aqui fornecido usa rotulagem multicolorida baseada na eletroporação uterónica para destacar os astrócitos corticais e analisar seu volume e morfologia com um pipeline de análise de imagem fácil de usar.
Abstract
Os astrócitos protoplasmáticos (ARP) localizados no córtex cerebral do rato são fortemente justtaposed, formando uma matriz tridimensional aparentemente contínua em estágios adultos. Até agora, nenhuma estratégia de imunossuagem pode desopara-los e segmentar sua morfologia em animais maduros e ao longo da corticogênese. A PrA cortical é originária de progenitores localizados no pálio dorsal e pode ser facilmente direcionada usando na eletroporação uterótica de vetores integrativos. Um protocolo é apresentado aqui para rotular essas células com a estratégia de marcadores de cor multiadaturar genomas (MAGIC), que conta com transposição piggyBac/Tol2 e recombinaçãocre/lox para expressar estochasticamente proteínas fluorescentes distintas (azul, ciano, amarelo e vermelho) dirigidas a compartimentos subcelulares específicos. Esta estratégia de mapeamento de destino multicolorido permite marcar em locais progenitores cortical próximos com combinações de marcadores de cor antes do início da gliogênese e rastrear seus descendentes, incluindo astrócitos, de estágios embrionários a adultos no nível celular individual. A rotulagem semi-esparsa obtida pelo ajuste da concentração de vetores eletroporados e contrastes de cores fornecidos pelos Marcadores de Cores Multiadutáveis (Marcadores MÁGICOs ou MM) permitem individualizar os astrócitos e destacar seu território e morfologia complexa, apesar de seu denso arranjo anatômico. Apresentado aqui está um fluxo de trabalho experimental abrangente, incluindo os detalhes do procedimento de eletroporação, aquisição de pilhas de imagens multicanais por microscopia confocal e segmentação tridimensional assistida por computador que permitirá ao experimentador avaliar o volume e a morfologia individuais da RPA. Em resumo, a eletroporação de Marcadores MÁGICOs fornece um método conveniente para rotular individualmente numerosos astrócitos e ter acesso às suas características anatômicas em diferentes estágios de desenvolvimento. Esta técnica será útil para analisar propriedades morfológicas de astrócito cortical em vários modelos de camundongos sem recorrer a cruzes complexas com linhas de repórter transgênicas.
Introduction
Os astrócitos desempenham inúmeras funções vitais no desenvolvimento cerebral e fisiologia1. Além de seu papel na barreira hemencefálica onde regulam a absorção de nutrientes e o fluxo sanguíneo, eles contribuem ativamente para a formação e função da sinapse, produzindo neuromoduladores que podem alterar a atividade neuronal e o comportamento2. Além disso, a disfunção astrócito contribui para uma variedade de distúrbios neurológicos3. Astrócitos localizados no córtex cerebral exibem uma morfologia elaborada permitindo um contato extensivo com processos neuronais. Esses contatos, essenciais para a função do circuito, também controlam morfogênese de astrócito e sinápgeno através das proteínas de adesão celular4. Neurocientistas precisam de ferramentas convenientes e robustas para investigar o desenvolvimento de astrócitos e morfogênese em seus modelos neurológicos de interesse. No entanto, devido à aposição próxima de astrócitos aos seus vizinhos e seu uniforme azulejo tridimensional, é desafiador destacar os astrócitos corticais e avaliar integralmente sua morfologia usando imunomarcadores.
Atualmente, duas principais estratégias de engenharia genética permitem a rotulagem e individualização de astrócitos corticais in situ: ativação esparsa de repórteres em linhas de camundongos transgênicos ou transgênese somática usando eletroporação de plasmídeos repórteres. A primeira estratégia conta com a criação de uma linha de rato repórter floxed com camundongos expressando uma forma indutível de recombinase cre ativada especificamente em astrócitos após a entrega de tamoxifen (por exemplo, Aldh1l1-CreERT25). Várias desvantagens estão associadas a essa estratégia. Em primeiro lugar, a criação de camundongos transgênicos requer um grande número de animais e vários ensaios são tipicamente necessários para determinar a dose adequada de tamoxifen para fornecer rotulagem adequadamente escassa de astrócitos corticais. Analisar fenótipos de astrócitos cortical em um modelo genético de interesse do rato exigirá ainda mais reprodução e consumo de camundongos. Além disso, na injeção de tamoxifen uterina é conhecida por interferir na parturição, dificultando a aplicação dessa estratégia ao estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento de astrócitos. A eletroporação in vivo de DNA é uma estratégia alternativa livre de tamoxifen que conta com um número mínimo de animais6. Realizada em estágios embrionários ou pós-natais, esta abordagem consiste em injetar plasmídeos repórteres nos ventrículos laterais de roedores seguidos por pulsos elétricos que criam poros na membrana celular, permitindo assim que o DNA entre células progenitoras que revestem o ventrículo. Posteriormente, os transgênicos repórteres transportados pelos plasmídeos eletroporados são processados pelo maquinário celular alvo e expressos7. Dois métodos de eletroporação foram descritos anteriormente para rotular os astrócitos cortical do rato: 1) Rotulagem de Astrocitos Pós-Natais por Eletroporação (PALE), que se baseia na eletroporação de plasmídeos epismídeos episômicos de 1 a 2 no estágio pós-natal4; 2) A estratégia StarTrack baseada na eletroporação utero (IUE) de múltiplos plasmídeos integrativos de cor única plasmids8,9,10. Embora essas duas técnicas rotulem eficientemente a A PR no córtex cerebral, elas também apresentam algumas limitações. Em sua versão inicial, ambos os métodos contam com um promotor de proteína ácida fibrilar gliarial (GFAP) para conduzir a expressão em astrócitos, o que pode influenciar a rotulagem em direção à glia radial, bem como astrócitos pial e reativos que expressam GFAP mais fortemente do que o repouso normal pra11,12. Em relação ao PALE, outras desvantagens são o estágio tardio da eletroporação, que impede a rotulagem de PrA (ou aqueles originários de progenitores delatórios precoces) e análise dos estágios iniciais do desenvolvimento da astroglia, e o uso de vetores episomais que se diluem através de sucessivas divisões durante a proliferação maciça que a A PR sofre durante a primeira semana pós-natal13,14. Em contraste com o PALE, StarTrack é baseado na eletroporação embrionária de plasmídeos integrativos repórteres que permitem rastrear a contribuição de progenitores embrionários e pós-natais para a PrA. Um esquema startrack atualizado que conta com o promotor ubiquitina C (UbC-StarTrack) alcança uma expressão mais ampla de repórteres fluorescentes tanto na descida neuronal quanto gliana (astrócitos incluídos) dos progenitores neurais15,16,17. No entanto, em sua versão atual, a implementação dessa abordagem é complexa, pois conta com uma mistura equimolar de 12 plasmídeos distintos expressando seis proteínas fluorescentes (FP) com excitação parcial e emissão de espectros sobrepostos.
Apresentado aqui é um método simples de rotulagem multicolorida baseada em eletroporação utero usando construções integrativas de repórteres impulsionadas por um promotor forte e amplamente ativo para destacar osstrócitos cortical14. Além disso, um fácil pipeline de análise de imagem utilizando tanto o software de análise de imagens licenciado (por exemplo, Imaris) quanto o acesso aberto (Vaa3D18,19,20) software de análise de imagens é fornecido para segmentar volume territorial de astrócito e arborização, respectivamente. Em comparação com os métodos descritos anteriormente, esta estratégia se baseia unicamente em transgênicos integrativos multicoloridos Marcadores de cores multiaddressáveis (Marcadores MÁGICOs ou MM21) direcionados ao compartimento celular citoplasmável e (opcionalmente) cuja expressão é impulsionada por um promotor de CAG sintético composto por um intensificador de cytomegalovirus, promotor de β-actina de coelho e β-globina-globinadecoelho Isso permite rotular e rastrear os astrócitos corticais, desde estágios embrionários até estágios pós-natais tardios, independente da expressão GFAP14,23. Cada um desses transgenes possui os seguintes quatro FP distintos: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP e tdTomato/mCherry, que exibem sobreposição espectral mínima que pode ser facilmente contornada com 1) Aquisição de canais sequenciais; 2) Poder de excitação otimizado e ganho de arrecadação; e 3) Filtrosdicróicos específicos para coletar janelas estreitas de emissão de FP. A estratégia MM usa a recombinaçãocre/lox com uma recombinase Cre auto-excisível (seCre) para conduzir a expressão estocástica de FP em uma população celular. Uma única cópia de MM transgene expressa FP de forma mutuamente exclusiva, enquanto vários transgenes dão origem a combinações fp, criando dezenas de matizes distintos. A integração genômica dos transgênicos é impulsionada pelo sistema de transposição piggyBac (PB) ou Tol224,25,26. Portanto, através da eletroporação utero, o kit de ferramentas MM e o ‘mosaico’ multicolorido que ele gera permitem a marcação simultânea de múltiplos progenitores cortical adjacentes e o rastreamento de sua descida gliana, incluindo astrócitos corticais, por longos períodos. Contrastes de cor resultantes da expressão de delineamento distinto da licença FP do contorno da Af e, posteriormente, extraem informações-chave sobre seu volume territorial (usando IMARIS) e morfologia complexa (usando Vaa3D). A estratégia multicolorida apresentada em detalhes aqui é um método conveniente e robusto que dá acesso rápido e fácil à superfície do astrócito cortical e à morfologia em camundongos do tipo selvagem em vários estágios de desenvolvimento, e é facilmente adaptável para investigar características anatômicas de astrócitos em modelos de camundongos de doenças neurológicas sem o uso de linhas de repórter transgênicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
No ute eletroporation (IUE) de marcadores MÁGICOS em progenitores corticais(Figura 1) permitiram a rotulagem de astrócitos em todo o córtex cerebral pós-natal em diferentes estágios pós-natais (P4-P7-P21, Figura 2). Curiosamente, o estágio da IUE não é crítico, pois a eletroporação realizada de E13,5 a E15,5 produz padrões de rotulagem semelhantes em relação aos astrócitos cortical14. No entanto, a localização de neurôn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a S. Fouquet e as instalações de imagem e núcleo animal do Institut de la Vision e Institut des Neurosciences de Montpellier (RM e RAM) pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Estudos de Région Ile-de-France e Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer to S.C, e da Université Paris-Saclay (Iniciativas Doutores Interdisciplinares) a L.A., por meio de financiamento do European Research Council (ERC-SG 336331, PI J. Valette) para E.H., pela Agence Nationale de la Recherche sob contratos ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , por Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) e pelo programa ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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