En Utero Electroporación de marcadores de color multiaconsejables integradores del genoma (MAGIC) para individualizar los astrocitos corticales del ratón
Summary
Los astrocitos azulejos de la corteza cerebral uniformemente, haciendo que el análisis de su morfología compleja desafiante a nivel celular. El protocolo proporcionado aquí utiliza etiquetado multicolor basado en electroporación de útero para señalar astrocitos corticales y analizar su volumen y morfología con una canalización de análisis de imágenes fácil de usar.
Abstract
Los astrocitos protoplasmáticos (PrA) ubicados en la corteza cerebral del ratón están estrechamente yuxtapuestos, formando una matriz tridimensional aparentemente continua en etapas adultas. Hasta ahora, ninguna estrategia de inmunodetención puede señalarlos y segmentar su morfología en animales maduros y en el transcurso de la corticogénesis. Cortical PrA se origina a partir de progenitores ubicados en el palio dorsal y se puede dirigir fácilmente utilizando en electroporación de úteros de vectores integrativos. Aquí se presenta un protocolo para etiquetar estas células con la estrategia de marcadores de color que integra el genoma (MAGIC), que se basa en la transposición piggyBac/Tol2 y la recombinacióncre/lox para expresar estocásticamente proteínas fluorescentes distintas (azul, cian, amarillo y rojo) dirigidas a compartimentos subcelulares específicos. Esta estrategia de mapeo del destino multicolor permite marcar in situ progenitores corticales cercanos con combinaciones de marcadores de color antes del inicio de la gliogénesis y rastrear a sus descendientes, incluidos los astrocitos, desde etapas embrionarias hasta adultas a nivel celular individual. El etiquetado semitransparente logrado ajustando la concentración de vectores electroporados y contrastes de color proporcionados por los marcadores de color multiajustables que integran el genoma (MAGIC Markers o MM) permiten individualizar astrocitos y destacar su territorio y su compleja morfología a pesar de su densa disposición anatómica. Aquí se presenta un flujo de trabajo experimental completo que incluye los detalles del procedimiento de electroporación, la adquisición de pilas de imágenes multicanal mediante microscopía confocal y la segmentación tridimensional asistida por computadora que permitirá al experimentador evaluar el volumen y la morfología individuales de PrA. En resumen, la electroporación de magic markers proporciona un método conveniente para etiquetar individualmente numerosos astrocitos y obtener acceso a sus características anatómicas en diferentes etapas de desarrollo. Esta técnica será útil para analizar las propiedades morfológicas de los astrocitos corticales en varios modelos de ratón sin recurrir a cruces complejos con líneas de reportero transgénicos.
Introduction
Los astrocitos desempeñan numerosas funciones vitales en el desarrollo cerebral y la fisiología1. Además de su papel en la barrera hematoencefálica donde regulan la absorción de nutrientes y el flujo sanguíneo, contribuyen activamente a la formación y función de la sinapsis mientras producen neuromoduladores que pueden alterar la actividad neuronal y el comportamiento2. Además, la disfunción de los astrocitos contribuye a una variedad de trastornos neurológicos3. Los astrocitos ubicados en la corteza cerebral muestran una morfología elaborada que permite un contacto extensivo con procesos neuronales. Estos contactos, esenciales para la función de circuito, también controlan la morfosis de astrocitos y la sinaptogénesis a través de proteínas de adhesión celular4. Los neurocientíficos necesitan herramientas convenientes y robustas para investigar el desarrollo de astrocitos y la morfosis en sus modelos neurológicos de interés. Sin embargo, debido a la estrecha aposición de astrocitos a sus vecinos y su baldosa tridimensional uniforme, es difícil señalar astrocitos corticales y evaluar exhaustivamente su morfología usando inmunomarcadores.
Actualmente, dos estrategias principales de ingeniería genética permiten el etiquetado e individualización de astrocitos corticales in situ: activación escasa del reportero en líneas transgénicas de ratón o transgénesis somática utilizando electroporación de plásmidos reporteros. La primera estrategia se basa en la cría de una línea de ratón reportero azotado con ratones que expresan una forma inducible de Cre recombinase activada específicamente en astrocitos en la administración de tamoxifeno (por ejemplo, Aldh1l1-CreERT25). Varias desventajas están asociadas con esta estrategia. En primer lugar, la cría de ratones transgénicos requiere un gran número de animales y normalmente se necesitan múltiples ensayos para determinar la dosis adecuada de tamoxifeno para proporcionar un etiquetado adecuadamente escaso de los astrocitos corticales. Analizar fenotipos de astrocitos corticales en un modelo genético de ratón de interés requerirá aún más reproducción y consumo de ratón. Además, en el útero se sabe que la inyección de tamoxifeno interfiere con la parturición, haciendo que esta estrategia sea difícil de aplicar al estudio de las primeras etapas del desarrollo de astrocitos. La electroporación in vivo del ADN es una estrategia alternativa libre de tamoxifeno que se basa en un número mínimo de animales6. Realizado ya sea en etapas embrionarias o postnatales, este enfoque consiste en inyectar plásmidos reporteros en los ventrículos laterales de roedores seguidos de pulsos eléctricos que crean poros en la membrana celular, permitiendo así que el ADN entre en células progenitoras que recubren el ventrículo. Posteriormente, los transgenes reporteros transportados por los plásmidos electroporados son procesados por la maquinaria celular dirigida y expresados7. Dos métodos de electroporación han sido descritos previamente para etiquetar astrocitos corticales del ratón: 1) Etiquetado postnatal de astrocitos por electroporación (PALE), que se basa en la electroporación de 1-2 plásmidos de reportero episomal monocolor en las primeras etapas postnatales4; 2) La estrategia StarTrack basada en la electroporación utero (IUE) de múltiples plásmidos de reportero integrador de un solo color8,9,10. Aunque estas dos técnicas etiquetan eficientemente a PrA en la corteza cerebral, también presentan algunas limitaciones. En su versión inicial, ambos métodos se basan en un promotor de proteína ácida fibrilarica glial (GFAP) para impulsar la expresión en astrocitos, lo que puede sesgar el etiquetado hacia la glia radial, así como astrocitos piales y reactivos que expresan GFAP con más fuerza de lo normal descansando PrA11,12. En cuanto al PALE, otras desventajas son la etapa tardía de la electroporación, que impide el etiquetado de pra de origen temprano (o los procedentes de progenitores de delaminación temprana) y el análisis de las primeras etapas del desarrollo de la astroglia, y el uso de vectores episomales que se diluyen a través de sucesivas divisiones durante la proliferación masiva que sufre pra durante la primera semana postnatal13,14. A diferencia del PALE, StarTrack se basa en la electroporación embrionaria de plásmidos de reporteros integrativos que permiten rastrear la contribución de progenitores embrionarios y posnatales a PrA. Un esquema StarTrack actualizado basado en el promotor de ubiquitina C (UbC-StarTrack)logra una expresión más amplia de los reporteros fluorescentes tanto en el descenso neuronal como en el glial (astrocitos incluidos) de los progenitores neuronales15,16,17. Sin embargo, en su versión actual, la implementación de este enfoque es compleja, ya que se basa en una mezcla emolar de 12 plásmidos distintos que expresan seis proteínas fluorescentes (FP) con excitación parcial y espectros de emisión superpuestos.
Aquí se presenta un sencillo método de etiquetado multicolor basado en electroporación de útero utilizando construcciones de reportero integrador impulsadas por un promotor fuerte y ampliamente activo para señalar astrocitos corticales14. Además, se proporciona una canalización de análisis de imágenes fácil utilizando tanto el software de análisis de imágenes con licencia (por ejemplo, Imaris) como el de acceso abierto (Vaa3D18,19,20)para segmentar el volumen territorial de astrocitos y la arborización, respectivamente. En comparación con los métodos descritos anteriormente, esta estrategia se basa únicamente en 1-2 transductores integradores multicolores Marcadores de Color Multiadermables Integradores del Genoma (MAGIC Markers o MM21)dirigidos al compartimento de células nucleares citoplasmáticas y (opcionalmente) cuya expresión es impulsada por un promotor sintético de CAG compuesto por un potenciador de citomegalovirus, promotor de pollo β-actin, y conejo β-globin splice acceptor site22. Esto permite el etiquetado y seguimiento de astrocitos corticales, desde etapas embrionarias hasta postnatales tardías, independientemente de la expresión GFAP14,23. Cada uno de estos transgenes lleva los siguientes cuatro FP distintos: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP y tdTomato/mCherry, que muestran una superposición espectral mínima que se puede eludir fácilmente con 1) adquisición secuencial de canales; 2) Potencia de excitación optimizada y ganancia de recolección; y 3) Filtros dichroic específicos para recoger ventanas de emisión fp estrechas. La estrategia MM utiliza la recombinación Cre/lox con una cre recombinase (seCre) autoexcitable para impulsar la expresión estocástica de la FP en una población celular. Una sola copia de MM transgene expresa fp de una manera mutuamente excluyente, mientras que múltiples transgenes dan lugar a combinaciones de FP, creando docenas de tonos distintos. La integración genómica de los transgéneos es impulsada por el sistema de transposición piggyBac (PB) o Tol224,25,26. Por lo tanto, a través de la electroporación del útero, el kit de herramientas MM y el ‘mosaico’ multicolor que genera permiten el marcado simultáneo de múltiples progenitores corticales adyacentes y el seguimiento de su descenso glial, incluyendo astrocitos corticales, durante largos períodos. Los contrastes de color resultantes de la expresión de fp diferente permiten la delineación del contorno de PrA y posteriormente extraen información clave sobre su volumen territorial (usando IMARIS) y morfología compleja (usando Vaa3D). La estrategia multicolor presentada en detalle aquí es un método conveniente y robusto que da un acceso rápido y fácil a la superficie de astrocito cortical y morfología en ratones de tipo salvaje en varias etapas de desarrollo, y es fácilmente adaptable para investigar las características anatómicas de astrocitos en modelos de ratón de enfermedades neurológicas sin usar líneas de reportero transgénicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la electroporación utero (IUE) de MAGIC Markers en progenitores corticales(Figura 1)permitió el etiquetado de astrocitos a lo largo de la corteza cerebral posnatal en diferentes etapas posnatales (P4-P7-P21, Figura 2). Curiosamente, la etapa de la IUE no es crítica, ya que la electroporación realizada de E13.5 a E15.5 produce patrones de etiquetado similares relativos a los astrocitos corticales14. Sin embargo, la ubicación de las…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a S. Fouquet y a las instalaciones de imágenes y núcleos animales del Institut de la Vision y el Institut des Neurosciences de Montpellier (RMN y RAM) por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por becas de Région Ile-de-France y La Fundación ARC pour la Recherche sur le Cancer a S.C, y de la Université Paris-Saclay (Iniciativas Doctorales Interdisciplinaires) a Los Ángeles, financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC-SG 336331, PI J. Valette) a E.H., por Agence Nationale de la Recherche bajo los contratos ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , por Fundación pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), por el Consejo Europeo de Investigación (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) y por el programa ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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