피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서
Summary
성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.
Abstract
마우스 대뇌 피질에 위치한 프로토플라스믹 성상세포(PrA)는 단단히 나란히 배치되어 성인 단계에서 명백하게 연속적인 3차원 매트릭스를 형성합니다. 지금까지, 어떤 면역 염색 전략은 그(것)들을 밖으로 단정하고 성숙한 동물및 코르티코 발생의 과정을 통해 그들의 형태를 분할할 수 없습니다. 피질 PrA는 등쪽 팔륨에 위치한 선조에서 유래하고 쉽게 통합 벡터의 자궁 전기 포기에 사용하여 표적화 할 수 있습니다. 프로토콜은 피기박/Tol2 전치 및Cre/lox 재조합에 의존하는 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커 전략으로 이러한 세포를 특정 세포 구획에 다루어주는 뚜렷한 형광 단백질(파란색, 시안, 노란색 및 빨간색)으로 라벨링하기 위해 여기에 제시됩니다. 이 다색 운명 매핑 전략은 교형성의 시작 전에 색상 마커의 조합과 함께 현장에서 표시하고 개별 세포 수준에서 배아에서 성인 단계에 성상 세포를 포함하여 자신의 후손을 추적 할 수 있습니다. 다주소 있는 게놈 통합 색상 마커(MAGIC Markers 또는 MM)에서 제공하는 전극형 벡터 및 색상 대비의 농도를 조정하여 달성된 반 스파스 라벨링은 조밀한 해부학적 배열에도 불구하고 성상 세포와 복잡한 형태를 개별화하고 영토및 복잡한 형태를 배제할 수 있게 합니다. 여기에 제시된 전기공분화 절차의 세부 사항, 공초점 현미경에 의한 멀티채널 이미지 스택 획득, 실험자가 개별 PrA 부피 및 형태학을 평가할 수 있는 컴퓨터 보조 3차원 세분화 등의 포괄적인 실험 워크플로우가 있습니다. 요약하자면, MAGIC Markers의 전기화는 수많은 성상세포에 개별적으로 라벨을 지정하고 다양한 발달 단계에서 해부학적 특징에 접근할 수 있는 편리한 방법을 제공합니다. 이 기술은 형질전환 기자 라인을 가진 복잡한 십자가에 의지하지 않고 다양한 마우스 모델에서 피질 성상세포 형태학적 특성을 분석하는 데 유용할 것이다.
Introduction
성상 세포는 뇌 발달 및 생리학1에서수많은 중요한 기능을 재생합니다. 그들은 영양소 섭취와 혈류를 조절 하는 혈액-뇌 장벽에서 그들의 역할 옆에, 그들은 적극적으로 신경 활동 및 행동을 변경할 수 있는 신경 변조기를 생산 하는 동안 시 냅 스 형성 및 기능에 기여2. 더욱이, 성상세포 기능 장애는 다양한 신경장애3에기여한다. 대뇌 피질에 있는 성상 세포는 신경 프로세스와 광대한 접촉을 가능하게 하는 정교한 형태 표시합니다. 회로 기능에 필수적인 이들 접촉은 세포 접착 단백질4를통해 성상세포 형태발생 및 시냅토 발생을 제어한다. 신경 과학자들은 관심의 그들의 신경 모델에서 성상 세포 발달 및 형태 발생을 조사하기 위하여 편리하고 강력한 공구가 필요합니다. 그러나, 그들의 이웃에 성상 세포의 가까운 삽화와 그들의 균일 한 입체 타일링으로 인해, 피질 성상신을 밖으로 선별하고 면역 마커를 사용하여 그들의 형태를 종합적으로 평가하는 것이 도전적입니다.
현재, 두 가지 주요 유전 공학 전략은 피질 성상세포의 라벨링 및 개별화를 가능하게 합니다: 기자 플라스미드의 전기포레이션을 사용하여 형질전환 마우스 선또는 체세포 간 발생에서 희소한 리포터 활성화. 첫 번째 전략은 타목시펜 납품 시 성상세포에서 특별히 활성화된 Cre 재조합제의 유도가능한 형태를 표현하는 마우스로 플로싱 리포터 마우스 라인을 사육하는 데 의존한다(예: Aldh1l1-CreERT25). 몇 가지 단점은이 전략과 관련이 있습니다. 첫째, 사육 형질 성생쥐는 많은 수의 동물을 필요로 하며, 여러 분석법은 전형적으로 피질 성상세포의 적절한 희소 라벨링을 제공하기 위해 타목시펜의 적절한 복용량을 결정하는 데 필요합니다. 관심의 유전 마우스 모델에서 피질 성상 세포 표현형을 분석하려면 더 많은 번식과 마우스 소비가 필요합니다. 더욱이, 자궁 타목시펜 주사는 부분화를 방해하는 것으로 알려져 있으며, 이 전략은 성상세포 발달의 초기 단계의 연구에 적용하기 어렵게 만듭니다. 생체 내 DNA 전기화는 동물의 최소 수에 의존하는 대체 타목시펜없는전략이다 6. 배아 또는 산후 단계에서 수행, 이 접근법은 설치류의 측면 심실에 기자 플라스미드를 주입하고 세포막에 기공을 만드는 전기 펄스로 구성되어 있으며, 따라서 DNA가 심실을 안대기하는 전구 세포에 들어갈 수 있도록 합니다. 이어서, 전기폴리플라스미드에 의해 운반된 리포터 전진은 표적 세포기계에 의해 처리되고7을발현한다. 두 개의 전기 기화 방법은 이전에 마우스 피질 성상세포에 레이블을 기재하였다: 1) 출생 후 성상 세포 (PALE)에 의한 성상 세포 라벨링, 이는 초기 산후 단계4에서1-2 단일 색 에피소피 기자 플라스미드의 전기 포기에 의존; 2) 여러 단일 색 통합 기자 플라스미드8,9,10의자궁 전기 화 (IUE)를 기반으로 스타 트랙 전략 . 이 두 기술은 대뇌 피질에서 PrA를 효율적으로 레이블을 지정하지만, 그들은 또한 몇 가지 한계를 제시한다. 그들의 초기 버전에서, 두 방법 모두 성상세포에서 발현을 구동하는 신경교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 프로모터에 의존, 이는 방사형 glia뿐만 아니라 일반 휴식 PrA 보다 더 강하게 GFAP를 표현하는 피알 및 반응성 성상세포로 라벨을 편향 할 수있다11,12. PALE에 관해서는, 그밖 단점은 초기 태어난 PrA의 표시를 방지하는 전기 기질의 늦은 단계입니다 (또는 초기 delaminating 선조에서 유래하는 그)와 천체 발달의 초기 단계의 분석, 그리고 PrA가 첫번째 산후 1주 동안 겪는 대규모 확산 도중 연속적인 분열을 통해 희석되는 episomal 벡터의 사용,14. PALE와 는 달리, StarTrack은 PrA에 배아와 산후 선조의 기여를 추적할 수 있는 통합 기자 플라스미드의 배아 전기화를 기반으로 합니다. 유비퀴틴 C 프로모터(UbC-StarTrack)에 의존하는업데이트된 스타트랙 방식은 신경전구15,16,17의신경전도 및 신경교 하강(성구포함)에서 형광 기자의 폭넓은 표현을 달성한다. 그러나, 현재 버전에서는 부분 적인 흥분 및 방출 스펙트럼 중복이 있는 6개의 형광 단백질 (FP)을 표현하는 12개의 명백한 플라스미드의 평형 혼합물에 의존하기 때문에 이 접근법의 구현은 복잡합니다.
여기에 제시된 우테로 전기화 기반의 멀티컬러 라벨링 방법은 피질성상세포(14)를배제하기 위해 강력하고 광범위하게 능동적인 프로모터에 의해 구동되는 통합 리포터 구조를 이용한 간단한 것이다. 또한, 허가된(예: Imaris)과 오픈 액세스(Vaa3D18,19,20)이미지 분석 소프트웨어를 모두 사용하는 쉬운 이미지 분석 파이프라인이 각각 성상세포 영토 볼륨 및 소극을 분할하도록 제공됩니다. 이전에 설명된 방법에 비해, 이 전략은 세포질로 향하는 1-2가지 색 통합 형 트랜스게네스 다중 게놈-통합 컬러 마커(MAGIC Markers 또는 MM21)에전적으로의존하며, (선택적으로) 핵세포 구획은 사이토메갈로바이러스 증강제, β 닭액틴 프로모터, β β 이를 통해 GFAP발현(14,23)과무관하게 배아에서 후기 산후 단계에 이르는 피질 성상세포의 라벨링 및 추적을 가능하게 한다. 이러한 각 유전자는 다음과 같은 네 가지 FP를 부담: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, 그리고 tdTomato/mCherry, 쉽게 우회 할 수 있는 최소한의 스펙트럼 중복을 표시 1) 순차 채널 취득; 2) 최적화 된 흥분 력 및 수집 이득; 및 3) 좁은 FP 방출 창을 수집하는 특정 이차 필터. MM 전략은Cre/lox재조합을 자기 흥분 가능한 Cre 재조합(seCre)과 결합하여 세포 집단에서 FP의 궤적 표현을 유도합니다. MM 트랜스진의 단일 사본은 상호 배타적인 방식으로 FP를 표현하고, 여러 개의 트랜스게네스는 FP 조합을 만들어 수십 개의 독특한 색조를 생성합니다. 게놈의 게놈 통합은 피기박(PB) 또는 Tol2 전치시스템(24,25,26)에의해 구동된다. 따라서 자궁 전기포공을 통해 MM 툴킷과 다색 ‘모자이크’를 통해 인접한 여러 피질 선조의 동시 표시와 피질 성상주기를 포함한 교반 하강의 추적을 장기간 가능하게 한다. 색상 대비는 PrA의 윤곽을 뚜렷하게 FP 허용 한 표현의 표현으로 인한 다음 자신의 영토 볼륨 (IMARIS 사용) 및 복잡한 형태 (Vaa3D 사용)에 대한 주요 정보를 추출합니다. 여기에 상세히 제시된 멀티컬러 전략은 다양한 발달 단계에서 야생형 마우스의 피질 성상세포 표면 및 형태에 빠르고 쉽게 접근할 수 있는 편리하고 견고한 방법이며, 형질대사라인을 사용하지 않고 신경질환의 마우스 모델에서 성상세포 해부학적 특징을 쉽게 조사할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
피질 전구체에서 MAGIC 마커의 자궁 전기기화(IUE)에서(도1)다른 산후 단계에서 산후 대뇌 피질 전체에 성상세포의 라벨링을 가능하게 하였다(P4-P7-P21, 도 2). 흥미롭게도, E13.5에서 E15.5로 수행된 전기포기는 피질 성상세포14에관한 유사한 라벨링 패턴을 산출하기 때문에 IUE의 단계는 중요하지 않습니다. 그러나, 피질 빈당에 표지된 피라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 S. Fouquet와 Institut de la Vision 및 Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI 및 RAM)의 이미징 및 동물 핵심 시설에 대한 기술 지원을 감사드립니다. 이 작품은 레기온 일 드 프랑스와 퐁당 ARC에서 S.C에 라 레체쉬 쉬르 르 암을 부어, 그리고 유니버시테 파리 – 사클레이 (이니셔티브 박사 박사 인터디스클레나테르)에서 L.A.에, 유럽 연구 위원회 (ERC-SG 336331, PI J. Valette)에서 E.H.에 자금을 지원함으로써, 기관 국립 드 라 레체쉬 계약에 따라 ANR-10-LABX-65 (LabEx 라이프 센스), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INB4 유럽연구위원회(ERC-CoG 649117, PI J. Livet)와 ATIP-Avenir 프로그램(PI K. Loulier)에 의해, 라 레체쉬 메디칼(Ref. DBI20141231328)을 지원한다.
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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