In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes
Summary
Gli astrociti piastrellano uniformemente la corteccia cerebrale, rendendo difficile l’analisi della loro complessa morfologia a livello cellulare. Il protocollo qui fornito utilizza l’etichettatura multicolore basata sull’elettroporazione in utero per singolo astrociti corticali e analizzarne il volume e la morfologia con una pipeline di analisi delle immagini intuitiva.
Abstract
Gli astrociti protoplasmatici (PrA) situati nella corteccia cerebrale del topo sono strettamente giustapposti, formando una matrice tridimensionale apparentemente continua negli stadi adulti. Finora, nessuna strategia di immunosottenzione può distinguerli e segmentarne la morfologia negli animali maturi e nel corso della corticogenesi. I PrA corticali provengono da progenitori situati nel pallio dorsale e possono essere facilmente mirati usando in utero l’elettroporazione di vettori integrativi. Qui viene presentato un protocollo per etichettare queste cellule con la strategia MAGIC (Genome-Integrating Color) Markers multiindirittabile, che si basa sulla trasposizione piggyBac/Tol2 e sulla ricombinazione Cre/lox per esprimere stocasticamente proteine fluorescenti distinte (blu, ciano, giallo e rosso) indirizzate a specifici compartimenti subcellulari. Questa strategia di mappatura del destino multicolore consente di contrassegnare in situ i progenitori corticali vicini con combinazioni di marcatori di colore prima dell’inizio della gliogenesi e di tracciare i loro discendenti, compresi gli astrociti, dagli stadi embrionali a quelli adulti a livello di singola cellula. L’etichettatura semi-sparsa ottenuta regolando la concentrazione di vettori elettroporati e i contrasti di colore forniti dai marcatori di colore multiindirizzabili per l’integrazione del genoma (MAGIC Markers o MM) consentono di individualizzare gli astrociti e di distinguerne il territorio e la morfologia complessa nonostante la loro densa disposizione anatomica. Qui è presentato un flusso di lavoro sperimentale completo che include i dettagli della procedura di elettroporazione, l’acquisizione di stack di immagini multicanale tramite microscopia confocale e la segmentazione tridimensionale assistita da computer che consentirà allo sperimentatore di valutare il volume e la morfologia dei singoli PrA. In sintesi, l’elettroporazione dei marcatori MAGIC fornisce un metodo conveniente per etichettare individualmente numerosi astrociti e ottenere l’accesso alle loro caratteristiche anatomiche in diversi stadi di sviluppo. Questa tecnica sarà utile per analizzare le proprietà morfologiche degli astrociti corticali in vari modelli di topi senza ricorrere a croci complesse con linee di reporter transgeniche.
Introduction
Gli astrociti svolgono numerose funzioni vitali nello sviluppo cerebrale e nella fisiologia1. Oltre al loro ruolo alla barriera ematico-encefalica dove regolano l’assorbimento dei nutrienti e il flusso sanguigno, contribuiscono attivamente alla formazione e alla funzione della sinapsi producendo neuromodulatori in grado di alterare l’attività e il comportamento neuronali2. Inoltre, la disfunzione degli astrociti contribuisce a una varietà di disturbineurologici 3. Gli astrociti situati nella corteccia cerebrale mostrano una morfologia elaborata che consente un ampio contatto con i processi neuronali. Questi contatti, essenziali per la funzione del circuito, controllano anche la morfogenesi degli astrociti e la sinaptogenesi attraverso le proteine di adesione cellulare4. I neuroscienziati hanno bisogno di strumenti convenienti e robusti per indagare lo sviluppo degli astrociti e la morfogenesi nei loro modelli neurologici di interesse. Tuttavia, a causa della stretta apposizione di astrociti ai loro vicini e della loro piastrellatura tridimensionale uniforme, è difficile trovare astrociti corticali e valutare in modo completo la loro morfologia usando immunomarcatori.
Attualmente, due principali strategie di ingegneria genetica consentono l’etichettatura e l’individualizzazione degli astrociti corticali in situ: scarsa attivazione del reporter nelle linee transgeniche del topo o transgenesi somatica usando l’elettroporazione dei plasmidi reporter. La prima strategia si basa sull’allevamento di una linea di topi reporter floxed con topi che esprimono una forma induttiva di Cre ricombinasi attivata specificamente negli astrociti al momento della consegna del tamoxifene (ad esempio, Aldh1l1-CreERT25). Diversi svantaggi sono associati a questa strategia. In primo luogo, l’allevamento di topi transgenici richiede un gran numero di animali e sono tipicamente necessari test multipli per determinare la dose corretta di tamoxifene per fornire un’etichettatura adeguatamente scarsa degli astrociti corticali. L’analisi dei fenotipi di astrociti corticali in un modello genetico di interesse del topo richiederà ancora più allevamento e consumo di topi. Inoltre, in utero l’iniezione di tamoxifene è nota per interferire con il parto, rendendo questa strategia difficile da applicare allo studio delle prime fasi dello sviluppo degli astrociti. L’elettroporazione del DNA in vivo è una strategia alternativa priva di tamoxifene che si basa su un numero minimo di animali6. Eseguito sia allo stadio embrionale che postnatale, questo approccio consiste nell’iniettare plasmidi reporter nei ventricoli laterale dei roditori seguiti da impulsi elettrici che creano pori nella membrana cellulare, permettendo così al DNA di entrare nelle cellule progenitrici che rivestono il ventricolo. Successivamente, i transgeni reporter trasportati dai plasmidi elettroporati vengono lavorati dalla macchina cellulare mirata ed espressi7. Due metodi di elettroporazione sono stati precedentemente descritti per etichettare gli astrociti corticali del topo: 1) Etichettatura postnatale degli astrociti mediante elettroporazione (PALE), che si basa sull’elettroporazione di 1-2 plasmidi reporter episomiali monocolore nelle prime fasi postnatali4; 2) La strategia StarTrack basata sull’elettroporazione in utero (IUE) di più plasmidi reporter integrativi monocolore8,9,10. Sebbene queste due tecniche etichettino efficacemente pra nella corteccia cerebrale, presentano anche alcune limitazioni. Nella loro versione iniziale, entrambi i metodi si basano su un promotore di proteine acide fibrillari gliali (GFAP) per guidare l’espressione negli astrociti, il che può polarizzare l’etichettatura verso glia radiali così come astrociti piali e reattivi che esprimono GFAP più fortemente del normale riposo PrA11,12. Per quanto riguarda PALE, altri svantaggi sono la fase avanzata dell’elettroporazione, che impedisce l’etichettatura del PrA primogenito (o di quelli originati da progenitori di delaminazione precoce) e l’analisi delle prime fasi dello sviluppo di astroglia, e l’uso di vettori episomici che si diluiscono attraverso successive divisioni durante la massiccia proliferazione che PrA subisce durante la prima settimana postnatale13,14. A differenza di PALE, StarTrack si basa sull’elettroporazione embrionale dei plasmidi reporter integrativi che consentono di tracciare il contributo dei progenitori sia embrionali che postnatali a PrA. Uno schema StarTrack aggiornato basato sul promotore ubiquitina C (UbC-StarTrack) raggiunge una più ampia espressione di reporter fluorescenti sia nella discesa neuronale che gliale (astrociti inclusi) dei progenitori neurali15,16,17. Tuttavia, nella sua versione attuale, l’implementazione di questo approccio è complessa, in quanto si basa su una miscela equimolare di 12 plasmidi distinti che esprimono sei proteine fluorescenti (FP) con eccitazione parziale e sovrapposizione di spettri di emissione.
Presentato qui è un semplice metodo di etichettatura multicolore basato sull’elettroporazione in utero utilizzando costrutti di reporter integrativi guidati da un promotore forte e ampiamente attivo per intasare gli astrociticorticali 14. Inoltre, viene fornita una semplice pipeline di analisi delle immagini utilizzando sia il software di analisi delle immagini concesso in licenza (ad esempio, Imaris) che l’accesso aperto (Vaa3D18 , 19,20) per segmentare rispettivamente il volume territoriale degli astrociti e l’arborizzazione. Rispetto ai metodi descritti in precedenza, questa strategia si basa esclusivamente su 1-2 transgeni integrativi multicolore Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers o MM21) diretti al compartimento cellulare citoplasmatico e (opzionalmente) nucleare la cui espressione è guidata da un promotore CAG sintetico composto da un potenziatore di citomegalovirus, promotore di pollo β-actina e coniglio β-globin splice acceptor site22. Ciò consente l’etichettatura e il tracciamento degli astrociti corticali, dagli stadi postnatali embrionali a quello tardo, indipendentemente dall’espressioneGFAP 14,23. Ognuno di questi transgeni porta i seguenti quattro FP distinti: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP e tdTomato/mCherry, che mostrano una sovrapposizione spettrale minima che può essere facilmente aggirata con 1) Acquisizione sequenziale del canale; 2) Potenza di eccitazione ottimizzata e guadagno di raccolta; e 3) Filtri dicroici specifici per raccogliere finestre di emissione FP strette. La strategia MM utilizza laricombinazione Cre/ lox con una ricombinasi cre auto-incisibile (seCre) per guidare l’espressione stocastica di FP in una popolazione cellulare. Una singola copia del transgene MM esprime FP in modo reciprocamente esclusivo, mentre più transgeni danno origine a combinazioni FP, creando dozzine di tonalità distinte. L’integrazione genomica dei transgeni è guidata dal sistema di trasposizione piggyBac (PB) o Tol224,25,26. Pertanto, attraverso l’elettroporazione utero, il toolkit MM e il ‘mosaico’ multicolore che genera consentono la marcatura simultanea di più progenitori corticali adiacenti e il tracciamento della loro discesa gliale, compresi gli astrociti corticali, per lunghi periodi. I contrasti di colore risultanti dall’espressione di FP distinti consentono la delimitazione del contorno di PrA e successivamente estraggono informazioni chiave sul loro volume territoriale (usando IMARIS) e sulla morfologia complessa (usando Vaa3D). La strategia multicolore presentata in dettaglio qui è un metodo comodo e robusto che dà un accesso rapido e facile alla superficie e alla morfologia degli astrociti corticali nei topi di tipo selvaggio in varie fasi dello sviluppo, ed è facilmente adattabile per indagare le caratteristiche anatomiche degli astrociti nei modelli di topi di malattie neurologiche senza utilizzare linee di reporter transgeniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
In utero l’elettroporazione (IUE) dei marcatori MAGIC nei progenitori corticali(Figura 1)ha permesso l’etichettatura degli astrociti in tutta la corteccia cerebrale postnatale in diversi stadi postnatali (P4-P7-P21, Figura 2). È interessante notare che lo stadio dell’IUE non è critico, in quanto l’elettroporazione eseguita da E13.5 a E15.5 produce modelli di etichettatura simili per quanto riguarda gli astrociticorticali 14. Tuttavia, l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo S. Fouquet e le strutture per l’imaging e il nucleo animale dell’Institut de la Vision e dell’Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI e RAM) per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio della Région Ile-de-France e della Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer a S.C e dall’Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) a Los Angeles, finanziando il Consiglio europeo della ricerca (ERC-SG 336331, PI J. Valette) a E.H., da Agence Nationale de la Recherche con contratti ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , di Fondation pour la Recherche Médicale (Rif. DBI20141231328), dal Consiglio Europeo delle Ricerche (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) e dal programma ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
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