In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten
Summary
Astrozyten kacheln die Großhirnrinde gleichmäßig, was die Analyse ihrer komplexen Morphologie auf zellulärer Ebene schwierig macht. Das hier bereitgestellte Protokoll verwendet eine mehrfarbige Etikettierung basierend auf der in utero Elektroporation, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und deren Volumen und Morphologie mit einer benutzerfreundlichen Bildanalyse-Pipeline zu analysieren.
Abstract
Protoplasmatische Astrozyten (PrA) in der Maus großhirnrinde sind eng nebeneinander gestellt, bilden eine scheinbar kontinuierliche dreidimensionale Matrix in Erwachsenenstadien. Bisher kann keine Immunfleckenstrategie sie herausgreifen und ihre Morphologie in reife Tiere und im Laufe der Kortikogenese segmentieren. Cortical PrA stammen von Vorläufern, die sich im dorsalen Pallium befinden und können leicht mit der Utero-Elektroporation integrativer Vektoren gezielt werden. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um diese Zellen mit der multiadressierbaren genomintegrierenden Farbe (MAGIC) Markers-Strategie zu kennzeichnen, die auf piggyBac/Tol2-Transposition undCre/lox-Rekombination beruht, um stochastisch unterschiedliche fluoreszierende Proteine (blau, cyan, gelb und rot) auszudrücken, die an bestimmte subzelluläre Kompartimente adressiert sind. Diese mehrfarbige Schicksalskartierungsstrategie ermöglicht es, in situ nahe gelegenen kortikalen Vorläufern vor Beginn der Gliogenese Kombinationen zu markieren und ihre Nachkommen, einschließlich Astrozyten, von embryonalen bis erwachsenen Stadien auf der Ebene der einzelnen Zellen zu verfolgen. Die halbkarsische Beschriftung, die durch die Anpassung der Konzentration von elektroporated Vektoren und Farbkontrasten erreicht wird, die von den Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers oder MM) bereitgestellt werden, ermöglichen es, Astrozyten zu individualisieren und ihr Territorium und ihre komplexe Morphologie trotz ihrer dichten anatomischen Anordnung herauszuarbeiten. Hier wird ein umfassender experimenteller Workflow vorgestellt, der die Details des Elektroporationsverfahrens, die Erfassung von Mehrkanal-Bildstapeln durch konfokale Mikroskopie und die computergestützte dreidimensionale Segmentierung enthält, die es dem Experimentator ermöglicht, einzelne PrA-Volumen und Morphologie zu bewerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Elektroporation von MAGIC Markern eine bequeme Methode bietet, um zahlreiche Astrozyten einzeln zu beschriften und in verschiedenen Entwicklungsstadien Zugang zu ihren anatomischen Merkmalen zu erhalten. Diese Technik wird nützlich sein, um kortikale astrozyte morphologische Eigenschaften in verschiedenen Mausmodellen zu analysieren, ohne auf komplexe Kreuze mit transgenen Reporterlinien zurückzugreifen.
Introduction
Astrozyten spielen zahlreiche wichtige Funktionen in der Gehirnentwicklung und Physiologie1. Neben ihrer Rolle an der Blut – Hirn-Schranke, wo sie die Nährstoffaufnahme und den Blutfluss regulieren, tragen sie aktiv zur Synapsenbildung und -funktion bei und produzieren Neuromodulatoren, die die neuronale Aktivität und das Verhalten verändern können2. Darüber hinaus trägt Astrozytendysfunktion zu einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen3. Astrozyten in der Großhirnrinde zeigen eine ausgeklügelte Morphologie, die einen umfassenden Kontakt mit neuronalen Prozessen ermöglicht. Diese Kontakte, die für die Schaltungsfunktion unerlässlich sind, steuern auch die Astrozytenmorphogenese und Synaptogenese durch Zelladhäianionsproteine4. Neurowissenschaftler benötigen bequeme und robuste Werkzeuge, um die Entwicklung von Astrozyten und die Morphogenese in ihren neurologischen Modellen von Interesse zu untersuchen. Aufgrund der engen Aneignung von Astrozyten an ihre Nachbarn und ihrer einheitlichen dreidimensionalen Fliesen ist es jedoch schwierig, kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und ihre Morphologie mit Immunmarkern umfassend zu bewerten.
Derzeit ermöglichen zwei hauptgenetische Strategien die Kennzeichnung und Individualisierung kortikaler Astrozyten in situ: spärliche Reporteraktivierung in transgenen Mauslinien oder somatische Transgenese mittels Elektroporation von Reporterplasmiden. Die erste Strategie beruht auf der Züchtung einer floxierten Reporter-Mauslinie mit Mäusen, die eine induzierbare Form der Cre-Rekombimeinase ausdrücken, die speziell in Astrozyten bei Dertoxifen-Lieferung aktiviert wird (z. B. Aldh1l1-CreERT25). Mit dieser Strategie sind mehrere Nachteile verbunden. Erstens erfordert die Zucht von transgenen Mäusen eine große Anzahl von Tieren und mehrere Tests sind in der Regel erforderlich, um die richtige Dosis von Tamoxifen zu bestimmen, um eine ausreichend spärliche Kennzeichnung kortikaler Astrozyten zu ermöglichen. Die Analyse kortikaler Astrozytenphänotypen in einem genetischen Mausmodell von Interesse erfordert noch mehr Züchtung und Mauskonsum. Darüber hinaus ist bei der Utero-Tamoxifen-Injektion bekannt, die mit der Parturtion zu stören, was diese Strategie schwierig macht, auf die Untersuchung der frühesten Stadien der Astrozytenentwicklung anzuwenden. In vivo DNA Elektroporation ist eine alternative tamoxifenfreie Strategie, die auf einer Minimalanzahl von Tieren beruht6. Dieser Ansatz, der entweder in embryonalen oder postnatalen Stadien durchgeführt wird, besteht darin, Reporterplasmide in die seitlichen Ventrikel von Nagetieren zu injizieren, gefolgt von elektrischen Impulsen, die Poren in der Zellmembran erzeugen, wodurch DIE DNA in Vorläuferzellen eindringen kann, die den Ventrikel aussäumen. Anschließend werden die von den elektroporated Plasmiden getragenen Reportertransgene von der Zielzellmaschinerie verarbeitet und7ausgedrückt. Zwei Elektroporationsmethoden wurden zuvor beschrieben, um kortikale Astrozyten der Maus zu kennzeichnen: 1) Postnatale Astrozytenkennzeichnung durch Elektroporation (PALE), die auf der Elektroporation von 1-2 einfarbigen episomalen Reporterplasmiden in frühen postnatalen Stadien4beruht; 2) Die StarTrack-Strategie basiert auf der in utero Elektroporation (IUE) von mehreren einfarbigen integrativen Reporterplasmiden8,9,10. Obwohl diese beiden Techniken PrA in der Großhirnrinde effizient kennzeichnen, stellen sie auch einige Einschränkungen dar. In ihrer ursprünglichen Version stützen sich beide Methoden auf einen glialfibrillären sauren Protein (GFAP) Promotor, um die Expression in Astrozyten anzutreiben, was die Kennzeichnung in Richtung radialer Glia sowie pialer und reaktiver Astrozyten verzerrt, die GFAP stärker ausdrücken als normale ruhende PrA11,12. In Bezug auf PALE sind andere Nachteile das späte Stadium der Elektroporation, das die Kennzeichnung von frühgeborener PrA (oder solche, die von frühen delainierenden Vorläufern stammen) und die Analyse der frühen Stadien der Astrogliaentwicklung verhindert, und die Verwendung von episomalen Vektoren, die durch aufeinander folgende Divisionen während der massiven Proliferation, die PrA während der ersten postnatalen Woche13,14durch sich verdünnt, verhindert. Im Gegensatz zu PALE basiert StarTrack auf der embryonalen Elektroporation integrativer Reporterplasmide, die es ermöglichen, den Beitrag embryonaler und postnataler Vorfahren zu PrA zu verfolgen. Ein aktualisiertes StarTrack-Schema, das sich auf den Ubiquitin C-Promoter (UbC-StarTrack) stützt, erreicht eine breitere Expression fluoreszierender Reporter sowohl im neuronalen als auch im glialischen Abstieg (einschließlich Astrozyten) der neuronalen Vorläufer15,16,17. In seiner aktuellen Fassung ist die Umsetzung dieses Ansatzes jedoch komplex, da er auf einer äquimolaren Mischung von 12 verschiedenen Plasmiden beruht, die sechs fluoreszierende Proteine (FP) mit teilweiser Anregung und Emissionsspektren überlappen.
Präsentiert wird hier eine einfache in utero Elektroporation-basierte Multicolor-Etikettierungsmethode mit integrativen Reporterkonstrukten, die von einem starken und breit aktiven Promotor angetrieben werden, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten14. Darüber hinaus wird eine einfache Bildanalyse-Pipeline mit lizenzierten (z.B. Imaris) und Open Access (Vaa3D18,19,20) Bildanalyse-Software zur Segmentierung von Astrozyten-Territorialvolumen bzw. Arborisierung zur Verfügung gestellt. Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Methoden stützt sich diese Strategie ausschließlich auf 1–2 mehrfarbige integrative Transgene Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers oder MM21), die auf das zytoplasmatische und (optional) Kernzellkompartiment gerichtet sind, dessen Expression von einem synthetischen CAG-Promotor angetrieben wird, der aus einem Cytomegalievirus-Enhancer, einem Huhn-β-Aktin-Promotor und einem Kaninchen-β-Globin-Spleis-Akzeptier-Site besteht. Dies ermöglicht die Kennzeichnung und Verfolgung kortikaler Astrozyten, von embryonalen bis spät postnatalen Stadien, unabhängig von GFAP-Expression14,23. Jedes dieser Transgene trägt die folgenden vier unterschiedlichen FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP und tdTomato/mCherry, die minimale spektrale Überlappung anzeigen, die leicht mit 1) Sequential Channel Acquisition umgangen werden kann; 2) Optimierte Anregungsleistung und Sammelgewinn; und 3) Spezifische dichroitische Filter zur Erfassung schmaler FP-Emissionsfenster. Die MM-Strategie verwendet Cre/lox Rekombination mit einer selbstexzisierbaren Cre Recombinase (seCre), um den stochastischen Ausdruck von FP in einer zellulären Population zu fördern. Eine einzige Kopie des MM-Transgens drückt FP auf sich gegenseitig ausschließende Weise aus, während mehrere Transgene FP-Kombinationen hervorrufen und Dutzende von unterschiedlichen Farbtönen erzeugen. Die genomische Integration der Transgene wird durch das PiggyBac (PB) oder Tol2 Transposition System24,25,26angetrieben. Daher ermöglichen das MM-Toolkit und das von ihm erzeugte mehrfarbige “Mosaik” durch die Utero-Elektroporation die gleichzeitige Markierung mehrerer benachbarter kortikaler Vorläufer und die Verfolgung ihres gliakalen Abstiegs, einschließlich kortikaler Astrozyten, über lange Zeiträume. Farbkontraste, die sich aus der Expression einer deutlichen FP-Abgrenzung der Kontur von PrA ergeben, und extrahieren anschließend wichtige Informationen über ihr territoriales Volumen (mit IMARIS) und komplexe Morphologie (mit Vaa3D). Die hier vorgestellte Multicolor-Strategie ist eine praktische und robuste Methode, die einen schnellen und einfachen Zugriff auf die kortikale Astrozytenoberfläche und Morphologie bei Wildtypmäusen in verschiedenen Entwicklungsstadien ermöglicht und leicht anpassungsfähig ist, um astrozyte anatomische Merkmale in Mausmodellen neurologischer Erkrankungen zu untersuchen, ohne transgene Reporterlinien zu verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Utero-Elektroporation (IUE) von MAGIC-Markern in kortikalen Vorläufern (Abbildung 1) ermöglichte die Kennzeichnung von Astrozyten in der gesamten postnatalen Großhirnrinde in verschiedenen postnatalen Stadien (P4-P7-P21, Abbildung 2). Interessanterweise ist das Stadium von IUE nicht kritisch, da die Elektroporation von E13.5 bis E15.5 ähnliche Beschriftungsmuster in Bezug auf kortikale Astrozyten14ergibt. Die Lage der markierte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken S. Fouquet und den bildgebenden und tierischen Kerneinrichtungen des Institut de la Vision und des Institut des Neurosciences de Montpellier (MRT und RAM) für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Région Ile-de-France und der Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer bis S.C und der Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) nach L.A., durch Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC-SG 336331, PI J. Valette) an E.H., durch Agence Nationale de la Recherche im Rahmen der Verträge ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImagings) , von Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), vom European Research Council (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) und vom ATIP-Avenir-Programm (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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