Isolement et culture des neurones primaires et glia de la vessie urinaire adulte de rat
Summary
Ce protocole tente d’établir un protocole reproductible pour les neurones primaires et l’isolement glia de la vessie de rat pour d’autres expériences cellulaires.
Abstract
Les voies urinaires inférieures ont deux fonctions principales, à savoir le stockage périodique de l’urine et la micturition; ces fonctions sont 20 grâce à la neurorégulation centrale et périphérique. Bien que des recherches approfondies sur le système nerveux des voies urinaires inférieures aient été menées, la plupart des études se sont concentrées sur la culture primaire. Ce protocole introduit une méthode pour l’isolement et la culture des neurones vésicaux et des gliales des rats Sprague-Dawley. Dans cette méthode, les neurones et les gliales ont été incubés dans un incubateur de 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 à 7 jours. En conséquence, ils sont devenus des formes matures adaptées aux expériences ultérieures connexes d’immunofluorescence. Des cellules ont été morphologiquement observées utilisant un microscope optique. Les neurones, les vésicules synaptiques et les gliales ont été identifiés par β-III-tubulin et MAP-2, Synapsin-1 et GFAP colorant, respectivement. Pendant ce temps, l’immunocytochimie a été exécutée sur plusieurs protéines neurotransmetteur-connexes, telles que l’acétyltransferase de choline, DYNLL2, et SLC17A9.
Introduction
L’appareil urinaire inférieur a deux fonctions principales : stockage périodique d’urine et micturition1. Le système nerveux inférieur des voies urinaires (LUTNS) contrôle ces fonctions et est délicat et sensible à de nombreuses neuropathies, qui peuvent être innées (porphyrie), acquises (maladie de Lyme), secondaires aux états pathologiques (cystopathie diabétique), médicament induit (cystite hémorragique), chirurgie causée (résection abdominopéine), ou blessures causées (lésions traumatiques de la moelleépinière) 2,3,4,5,6,7. Dans les études physiologiques/pathologiques, les expériences in vivo et in vitro sont tout aussi importantes. Alors que la recherche in vivo sur LUTNS a été menée à des niveaux organiques, cellulaires et moléculaires pendant un certain temps, la recherche in vitro sur les neurones primaires de la vessie urinaire est presque inexistante8,9. Bien que la présente étude soit limitée, nous espérons être les pionniers de la recherche dans ce domaine afin que d’autres chercheurs puissent l’améliorer. De cette façon, cette co-culture peut mener à une compréhension cellulaire du dysfonctionnement physiologique dans les phénotypes, tels que le dysfonctionnement de neurone de réservoir souple.
Contrairement aux muscles entériques avec une directionnalité claire des cellules musculaires en couches discrètes, les muscles de la vessie ne sont pas organisés10. Par conséquent, au lieu d’éplucher la couche externe de la vessie, cette méthode propose de digérer toute la vessie pour réduire la difficulté d’opération et raccourcir le temps de prétraitement pour un taux élevé de survie cellulaire.
En suivant cette méthode, nous pouvons obtenir une culture mixte des neurones et d’autres cellules. Les autres cellules sont indispensables car leur présence imite un environnement in vivo11. En outre, ces cellules fournissent les substances qui ne sont pas disponibles dans le milieu.
Cette méthode implique deux étapes pour la digestion. Tout d’abord, collagène de type II est utilisé pour hydrolyser le collagène, suivie par la trypsine, pour dissocier le tissu encellules 10. De cette façon, les tissus vésicaux sont dispersés en cellules individuelles, puis se développent relativement indépendamment. Lorsque la culture des neurones mûrit, les neurones peuvent être utilisés pour l’imagerie ou des tests fonctionnels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Préparation des plaques
L’utilisation de couvercles de verre dans des plaques de culture de 6, 12 ou 48 puits pour des expériences d’imagerie immunofluorescente ou calcique est une opération économique et économe en échantillons. Les cellules se développent bien dans les plaques sans coverslips pendant la préparation des cultures cellulaires primaires. Par conséquent, les coverslips sont dispensables dans des expériences, telles que la tache occidentale ou la réaction en chaîne de poly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été appuyée par la National Natural Science Foundation of China (Subvention no 81673676) et le Dongguan Science and Technology Bureau (Subvention no 2019622101002). Les auteurs remercient le Dr Maryrose Sullivan (professeure adjointe en chirurgie, Harvard Medical School) pour ses consultations techniques.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
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