Isolamento e Cultura dos Neurônios Primários e Glia da Bexiga Urinária de Ratos Adultos
Summary
Este protocolo tenta estabelecer um protocolo repetível para neurônios primários e isolamento de glia da bexiga de rato para novos experimentos celulares.
Abstract
O trato urinário inferior tem duas funções principais: armazenamento periódico de urina e micturição; essas funções são mediadas através da neuroregulação central e periférica. Embora tenham sido realizadas extensas pesquisas sobre o sistema nervoso do trato urinário inferior, a maioria dos estudos tem se concentrado na cultura primária. Este protocolo introduz um método para o isolamento e cultura dos neurônios da bexiga e da glia dos ratos de Sprague-Dawley. Neste método, os neurônios e a glia foram incubados em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 5-7 dias. Como resultado, eles cresceram em formas maduras adequadas para experimentos de imunofluorescência subsequentes relacionados. As células foram observadas morfologicamente usando um microscópio óptico. Neurônios, vesículas sinápticas e glia foram identificados por β-III-tubulina e MAP-2, Sinapsin-1 e GFAP, respectivamente. Enquanto isso, a imunocitoquímica foi realizada em várias proteínas relacionadas ao neurotransmissor, como acetiltransferase de colina, DYNLL2 e SLC17A9.
Introduction
O trato urinário inferior tem duas funções principais: armazenamento periódico de urina e micturição1. O sistema nervoso do trato urinário inferior (LUTNS) controla essas funções e é delicado e suscetível a muitas neuropatias, que podem ser inatas (porfiria), adquiridas (doença de Lyme), secundárias aos estados da doença (cistopatia diabética), induzida por drogas (cistite hemorrágica), cirurgia causada (ressecção abdominoperineal) ou lesão causada (lesão medular traumática)2,3,4,5,6,7. Em estudos fisiológicos/patológicos, experimentos in vivo e in vitro são igualmente importantes. Enquanto a pesquisa in vivo em LUTNS tem sido conduzida em níveis de órgãos, celulares e moleculares há algum tempo, a pesquisa in vitro sobre neurônios primários da bexiga urinária é quase inexistente8,9. Embora o presente estudo seja limitado, esperamos ser pioneiros em pesquisas nessa área para que outros pesquisadores possam melhorá-la. Dessa forma, essa cocultura pode levar a uma compreensão celular da disfunção fisiológica em fenótipos, como a disfunção do neurônio da bexiga.
Em contraste com os músculos entéricos com uma direcionalidade clara das células musculares em camadas discretas, os músculos da bexiga são desorganizados10. Portanto, em vez de descascar a camada externa da bexiga, este método propõe digerir toda a bexiga para reduzir a dificuldade de operação e encurtar o tempo de pré-processamento para uma alta taxa de sobrevivência celular.
Seguindo este método, podemos obter uma cultura mista de neurônios e outras células. As outras células são indispensáveis porque sua presença imita um ambiente in vivo11. Além disso, essas células fornecem as substâncias que não estão disponíveis no meio.
Este método envolve dois passos para a digestão. Primeiro, a colagem tipo II é usada para hidrolisar colágeno, seguido de trippsina, para dissociar o tecido nas células10. Dessa forma, os tecidos da bexiga são dispersos em células únicas e, em seguida, crescem relativamente independentes. Quando a cultura dos neurônios amadurece, os neurônios podem ser usados para imagens ou ensaios funcionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparação da placa
O uso de tampas de vidro em placas de cultura de 6, 12 ou 48 poços para experimentos de imagens imunofluorescentes ou de cálcio é uma operação econômica e poupadora de amostras. As células crescem bem em placas sem tampas durante a preparação das culturas celulares primárias. Portanto, as tampas são dispensáveis em experimentos, como a mancha ocidental ou a reação em cadeia de polimerase. Além disso, o revestimento é um passo necessário antes de emplacamento de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 81673676) e pelo Dongguan Science and Technology Bureau (Grant nº 2019622101002). Os autores agradecem à Dra.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
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