Summary

Изоляция и культура первичных нейронов и Глиа от взрослых Крыса мочевого пузыря

Published: May 23, 2020
doi:

Summary

Этот протокол пытается установить повторяемый протокол для первичных нейронов и глиа изоляции от крысиного пузыря для дальнейших клеточных экспериментов.

Abstract

Нижний мочевыводящих путей имеет две основные функции, а именно, периодическое хранение мочи и micturition; эти функции опосредовано через центральную и периферическую нейрорегуляцию. Хотя обширные исследования на нижней мочевыводящих путей нервной системы была проведена, большинство исследований были сосредоточены на первичной культуры. Этот протокол вводит метод изоляции и культуры нейронов мочевого пузыря и глии от крыс Спраг-Доули. В этом методе, нейроны и глии были инкубированы в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор в течение 5-7 дней. В результате они переросли в зрелые формы, пригодные для последующих экспериментов по иммунофлюоресценции. Клетки морфологически наблюдались с помощью оптического микроскопа. Нейроны, синаптические пузырьки и глиа были выявлены β-III-тубулином и MAP-2, Синапсин-1 и GFAP окрашивание, соответственно. Между тем, иммуноцитохимия была выполнена на нескольких нейромедиатора связанных белков, таких как холин ацетилтрансферазы, DYNLL2, и SLC17A9.

Introduction

Нижний мочевыводящих путей имеет две основные функции: периодическое хранение мочи и micturition1. Нижняя мочевыводящих путей нервной системы (LUTNS) контролирует эти функции и деликатный и восприимчивы ко многим невропатии, которые могут быть врожденными (порфирия), приобретенные (болезнь Лайма), вторичные состояния болезни (диабетическая цистопатия), препарат индуцированной (геморрагический цистит), вызванные (абдоминоперинальной ресекции),илитравмы,вызванные (травматическая травма спинного мозга)2, 3 , 5 , 5,5. В физиологических/патологических исследованиях не менее важны эксперименты in vivo и in vitro. В то время как in vivo исследования lutNS были проведены на уровне органов, клеток и молекулярных в течение некоторого времени, в пробирке исследования первичных нейронов из мочевогопузыря почти не существует 8,9. Хотя настоящее исследование ограничено, мы надеемся, что пионер исследований в этой области, с тем чтобы другие исследователи могли улучшить его. Таким образом, эта ко-культура может привести к клеточному пониманию физиологической дисфункции в фенотипах, таких как дисфункция нейронов мочевого пузыря.

В отличие от энтерических мышц с четкой направленностью мышечных клеток в дискретные слои, мышцы мочевого пузыря неорганизованы10. Поэтому вместо того, чтобы отслаиваться от внешнего слоя мочевого пузыря, этот метод предлагает переваривать весь мочевой пузырь, чтобы уменьшить сложность работы и сократить время предварительной обработки для высокой выживаемости клеток.

Следуя этому методу, мы можем получить смешанную культуру нейронов и других клеток. Другие клетки незаменимы, потому что их присутствие имитирует среду in vivo11. Кроме того, такие клетки обеспечивают вещества, которые отсутствуют в среде.

Этот метод включает в себя два шага для пищеварения. Во-первых, коллагеназа типа II используется для гидролизового коллагена, а затем трипсина, чтобы разобщить ткани в клетки10. Таким образом, ткани мочевого пузыря рассредоточены по одиночным клеткам, а затем становятся относительно независимыми. Когда культура нейронов созревает, нейроны могут быть использованы для визуализации или функциональных анализов.

Protocol

Все экспериментальные протоколы и процедуры для животных соответствовали этическим принципам Национального исследовательского совета. 1. Подготовка материалов Стерилизовать все инструменты и ddH2O с помощью автоклава перед выполнением эксперимента. Инструм?…

Representative Results

В процессе первичной клеточной культуры приобретенные клетки были круглыми с яркими и четкими границами перед прикрепленным состоянием. По мере роста нейронов дендриты и аксоны стали отчетливыми. После 5-7 дней культуры, нейроны достигли зрелой форме с длинными проекциями, которые был?…

Discussion

Подготовка плиты
Использование стеклянных крышки в 6-, 12-, или 48-хорошо культуры пластин для иммунофлуоресцентных или кальция изображений экспериментов является экономичным и образца щадящей операции. Клетки хорошо растут в пластинах без крышки во время подготовки первичны?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No 81673676) и Бюро науки и технологий Дунгуаня (Grant No 201962101002). Авторы благодарят доктора Мэрироуз Салливан (помощник профессора хирургии Гарвардской медицинской школы) за техническое консультирование.

Materials

0.25% trypsin Gibico 15050065 Enzyme digestion
48-well culture plate Corning 3548 Coating dish
antibiotic/antimycotic Gibico 15240062 Culture media/Rinse media
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody Santa Cruz sc-33673 ICC
B-27 Gibico 17504044 Culture media
BSA Fraction V Gibico 332 Enzyme digestion
Choline Acetyltransferase Antibody Abcam ab18736 ICC
CO2 Incubator Heraeus B16UU Cells culture
Collagenase type II Sigma 2593923 Enzyme digestion
DMEM/F-12 Gibico 11330032 Rinse media
DYNLL2 Antibody Santa Cruz sc-13969 ICC
Fetal Bovine Serum Gibico 10100147 Culture media/Rinse media
Forceps Shanghai Jin Zhong Medical Devices 1383 10 cm; Sterile operation
Glass breakers Huan Qiu Medical Devices 1101 50 ml; Sterile operation
Glass coverslips WHB Scientific WHB-48-CS Coating dish
Glass dishes Huan Qiu Medical Devices 1177 100 mm; Sterile operation
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 Southernbiotech 3050-30 ICC
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 Southernbiotech 3050-30 ICC
Hoechst 33342 BD 561908 ICC
Laminar flow bench Su Jie Medical Devices CB 1400V Sterile operation
Laminin Sigma L2020 Coating dish
L-glutamine Gibico 25030081 Culture media
MAP-2 Antibody Affinity AF5156 ICC
Murine GDNF Peprotech AF45044 Culture media
Neurobasal-A Medium Gibico 10888022 Culture media
Ophthalmic scissors Shanghai Jin Zhong Medical Devices J21010 12.5 cm; Sterile operation
Pipettes Eppendorf 3120000240 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting
Pipettes Eppendorf 3120000267 10-100 ul; Reagent and sample pipetting
Poly-D-lysine Sigma P7280 Coating dish
Refrigerated centrifuge Ping Fan Instrument TGL-16A Enzyme digestion
Shaking incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments T8-1 Enzyme digestion
SLC17A9 Antibody MBL International BMP079 ICC
Spoons nucleus divider Shanghai Jin Zhong Medical Devices YZR030 12 cm; Sterile operation
Substance P Antibody Santa Cruz sc-58591 ICC
Surgical scissors Shanghai Jin Zhong Medical Devices J21130 16 cm; Sterile operation
Surgical towel Fu Kang Medical Devices 5002 40 x 50 cm; Sterile operation
Synapsin-1 Antibody CST 5297T ICC
Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) Affinity AF7011 ICC

References

  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
  2. Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
  3. Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
  4. Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
  5. Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
  6. Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
  7. Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
  8. Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
  9. Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
  10. Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
  11. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
  12. Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
  13. Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
  14. Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
  15. Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
  16. Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
  17. Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
  18. Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
  20. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  21. Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
check_url/61177?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Wang, R., Huang, Z., Ren, W., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B., Huang, P., Cao, H. Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder. J. Vis. Exp. (159), e61177, doi:10.3791/61177 (2020).

View Video