Aislamiento y cultura de las neuronas primarias y Glia de la vejiga urinaria de rata adulta
Summary
Este protocolo intenta establecer un protocolo repetible para las neuronas primarias y el aislamiento de glia de la vejiga de rata para experimentos celulares posteriores.
Abstract
Las vías urinarias inferiores tienen dos funciones principales, a saber, el almacenamiento periódico de orina y la micturición; estas funciones se median a través de la neuroregulación central y periférica. Aunque se ha realizado una extensa investigación sobre el sistema nervioso del tracto urinario inferior, la mayoría de los estudios se han centrado en el cultivo primario. Este protocolo introduce un método para el aislamiento y cultivo de las neuronas de la vejiga y la glia de las ratas Sprague-Dawley. En este método, las neuronas y la glia fueron incubadas en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 5-7 días. Como resultado, se convirtieron en formas maduras adecuadas para experimentos de inmunofluorescencia posteriores relacionados. Las células fueron observadas morfológicamente usando un microscopio óptico. Las neuronas, las vesículas sinápticas y la glia fueron identificadas por β-III-tubulina y MAP-2, Synapsin-1 y manchas GFAP, respectivamente. Mientras tanto, la inmunocitoquímica se realizó en varias proteínas relacionadas con el neurotransmisor, como la acetiltransferasa de colina, DYNLL2 y SLC17A9.
Introduction
Las vías urinarias inferiores tienen dos funciones principales: almacenamiento periódico de orina y micturición1. El sistema nervioso del tracto urinario inferior (LUTNS) controla estas funciones y es delicado y susceptible a muchas neuropatías, que pueden ser innatas (porfiria), adquiridas (enfermedad de Lyme), secundarias a estados de enfermedad (cistopatía diabética), inducida por fármacos (cistitis hemorrágica), cirugía causada (resección abjope) o lesión causada (lesión traumática de la médula espinal)2,3,4,5,6,7. En estudios fisiológicos/patológicos, los experimentos in vivo e in vitro son igualmente importantes. Mientras que la investigación in vivo sobre LUTNS se ha llevado a cabo a niveles de órganos, celulares y moleculares durante algún tiempo, la investigación in vitro sobre las neuronas primarias de la vejiga urinaria es casi inexistente8,9. Aunque el presente estudio es limitado, esperamos ser pioneros en la investigación en esta área para que otros investigadores puedan mejorarla. De esta manera, este co-cultivo puede conducir a una comprensión celular de la disfunción fisiológica en fenotipos, como la disfunción de las neuronas de la vejiga.
A diferencia de los músculos entéricos con una dirección clara de las células musculares en capas discretas, los músculos de la vejiga están desorganizados10. Por lo tanto, en lugar de despegar la capa externa de la vejiga, este método propone digerir toda la vejiga para reducir la dificultad de operación y acortar el tiempo de preprocesamiento para una alta tasa de supervivencia celular.
Siguiendo este método, podemos obtener un cultivo mixto de neuronas y otras células. Las otras células son indispensables porque su presencia imita un entorno in vivo11. Además, estas células proporcionan las sustancias que no están disponibles en el medio.
Este método implica dos pasos para la digestión. En primer lugar, la colágeno tipo II se utiliza para hidrolizando colágeno, seguido de trippsina, para disociar el tejido en las células10. De esta manera, los tejidos de la vejiga se dispersan en células individuales y luego crecen relativamente independientes. Cuando el cultivo de las neuronas madura, las neuronas se pueden utilizar para imágenes o ensayos funcionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparación de placas
El uso de manchas de vidrio en placas de cultivo de 6, 12 o 48 pozos para experimentos de imágenes inmunofluorescentes o de calcio es una operación económica y que ahorra muestras. Las células crecen bien en placas sin manchas durante la preparación de cultivos celulares primarios. Por lo tanto, los coverslips son prescindibles en experimentos, como la blot occidental o la reacción en cadena de la polimerasa. Además, el recubrimiento es un paso necesario antes de atorniga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 81673676) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de Dongguan (Subvención Nº 2019622101002). Los autores agradecen a la Dra. Maryrose Sullivan (Profesora Asistente de Cirugía de la Escuela de Medicina de Harvard) por la consultoría técnica.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
