Isolamento e cultura dei neuroni primari e degli glia dalla vescica urinaria del ratto adulto
Summary
Questo protocollo tenta di stabilire un protocollo ripetibile per i neuroni primari e l’isolamento degli glia dalla vescica del ratto per ulteriori esperimenti cellulari.
Abstract
Il tratto urinario inferiore ha due funzioni principali, vale a dire la conservazione periodica delle urine e la micturizione; queste funzioni sono mediate attraverso la neuroregolazione centrale e periferica. Sebbene sia stata condotta un’ampia ricerca sul sistema nervoso del tratto urinario inferiore, la maggior parte degli studi si è concentrata sulla cultura primaria. Questo protocollo introduce un metodo per l’isolamento e la coltura dei neuroni vescicali e degli glia dei ratti Sprague-Dawley. In questo metodo, i neuroni e glia sono stati incubati in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 5-7 giorni. Di conseguenza, sono cresciuti in forme mature adatte ai successivi esperimenti di immunofluorescenza correlati. Le cellule sono state osservate morfologicamente usando un microscopio ottico. Neuroni, vescicole sinaptiche e glia sono stati identificati rispettivamente da β-III-tubulina e MAP-2, Synapsin-1 e GFAP. Nel frattempo, l’immunocitochimica è stata eseguita su diverse proteine correlate al neurotrasmettitore, come la colina acetiltransferasi, DYNLL2 e SLC17A9.
Introduction
Il tratto urinario inferiore ha due funzioni principali: conservazione periodica delle urine e micturizione1. Il sistema nervoso del tratto urinario inferiore (LUTNS) controlla queste funzioni ed è delicato e suscettibile a molte neuropatie, che possono essere innate (porfiria), acquisite (malattia di Lyme), secondarie agli stati di malattia (cistopatia diabetica), indotte da farmaci (cistite emorragica), chirurgia causata (resezione addominoperineale) o lesioni causate (lesione traumatica del midollo spinale)2,3,4,5,6,7. Negli studi fisiologici/patologici, gli esperimenti in vivo e in vitro sono ugualmente importanti. Mentre la ricerca in vivo sull’LUTNS è stata condotta a livello di organo, cellulare e molecolare per qualche tempo, la ricerca in vitro sui neuroni primari della vescica urinaria è quasi inesistente8,9. Sebbene il presente studio sia limitato, speriamo di essere pionieri della ricerca in questo settore in modo che altri ricercatori possano migliorarla. In questo modo, questa co-coltura può portare a una comprensione cellulare della disfunzione fisiologica nei fenotipi, come la disfunzione neuronale della vescica.
A differenza dei muscoli enterici con una chiara direzionalità delle cellule muscolari in strati discreti, i muscoli della vescica sono disorganizzati10. Pertanto, invece di staccare lo strato esterno della vescica, questo metodo propone di digerire l’intera vescica per ridurre la difficoltà di funzionamento e abbreviare i tempi di pre-elaborazione per un alto tasso di sopravvivenza cellulare.
Seguendo questo metodo, possiamo ottenere una coltura mista di neuroni e altre cellule. Le altre cellule sono indispensabili perché la loro presenza imita un ambiente in vivo11. Inoltre, tali cellule forniscono le sostanze che non sono disponibili nel mezzo.
Questo metodo prevede due passaggi per la digestione. In primo luogo, la collagenasi di tipo II viene utilizzata per idrolizzare il collagene, seguita dalla tripparina, per dissociare il tessuto nelle cellule10. In questo modo, i tessuti della vescica vengono dispersi in singole cellule e quindi crescono relativamente indipendenti. Quando la coltura dei neuroni matura, i neuroni possono essere utilizzati per l’imaging o test funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparazione piastra
L’uso di coverlips in vetro in piastre di coltura da 6, 12 o 48 pozzi per esperimenti di imaging immunofluorescente o di calcio è un’operazione economica e parsimonioso. Le cellule crescono bene in piastre senza coverlips durante la preparazione di colture cellulari primarie. Pertanto, le coverlips sono dispensabili in esperimenti, come la macchia occidentale o la reazione a catena della polimerasi. Inoltre, il rivestimento è un passo necessario prima di placcare le celle, con o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (Grant n. 81673676) e dal Dongguan Science and Technology Bureau (Grant n. 2019622101002). Gli autori ringraziano la Dott.ssa Maryrose Sullivan (Assistente professore in Chirurgia, Harvard Medical School) per la consulenza tecnica.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
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