Yetişkin Sıçan İdrar Kesesinden Primer Nöronların ve Gliaların İzolasyonu ve Kültürü
Summary
Bu protokol, birincil nöronlar için tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaya ve daha fazla hücresel deney için sıçan mesanesinden glia izolasyonu oluşturmaya çalışır.
Abstract
Alt idrar yolu, periyodik idrar depolama ve miktürasyon olmak üzere iki ana işleve sahiptir; bu fonksiyonlar merkezi ve periferik nöroregülasyon yoluyla aracılık edilir. Alt idrar yolu sinir sistemi hakkında kapsamlı araştırmalar yapılmış olmasına rağmen, çoğu çalışma birincil kültüre odaklanmıştır. Bu protokol, Sprague-Dawley sıçanlarından mesane nöronlarının ve glialarının izolasyonu ve kültürü için bir yöntem sunar. Bu yöntemde nöronlar ve glialar 5-7 gün boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde inkübe edildi. Sonuç olarak, ilgili sonraki immünofluoresans deneyleri için uygun olgun şekillere dönüştüler. Hücreler morfolojik olarak optik mikroskop kullanılarak gözlendi. Nöronlar, sinaptik veziküller ve glia sırasıyla β-III-tubulin ve MAP-2, Synapsin-1 ve GFAP boyama ile tanımlanmıştır. Bu arada, immünosistokimya kolin asetiltransfenaz, DYNLL2 ve SLC17A9 gibi nörotransmitter ile ilgili çeşitli proteinler üzerinde yapıldı.
Introduction
Alt idrar yollarının iki ana işlevi vardır: periyodik idrar depolama ve miktürasyon1. Alt idrar yolu sinir sistemi (LUTNS) bu fonksiyonları kontrol eder ve hassas ve birçok nöropatiye duyarlıdır, doğuştan gelen (porfiri), edinilmiş (Lyme hastalığı), hastalık durumlarına ikincil (diyabetik sistopati), ilaca bağlı (hemorajik sistit), neden olduğu ameliyat (abdominoperineal rezeksiyon) veya yaralanma (travmatik omurilik yaralanması)2, 3,4,5,6,7olabilir. Fizyolojik/patolojik çalışmalarda in vivo ve in vitro deneyler de aynı derecede önemlidir. LUTNS ile ilgili in vivo araştırmalar bir süredir organ, hücresel ve moleküler düzeylerde yapılırken, idrar kesesinden birincil nöronlar üzerinde in vitro araştırmalar yok denecek kadarazdır 8,9. Mevcut çalışma sınırlı olsa da, diğer araştırmacıların geliştirebilmesi için bu alandaki araştırmalara öncülük etmeyi umuyoruz. Bu şekilde, bu ortak kültür, mesane nöron disfonksiyonu gibi fenotiplerdeki fizyolojik disfonksiyonun hücresel olarak anlaşılmasına yol açabilir.
Kas hücrelerinin ayrık katmanlara açık bir yönüne sahip enterik kasların aksine, mesanenin kasları örgütsüz10. Bu nedenle, bu yöntem mesanenin dış tabakasını soymak yerine, çalışma zorlığını azaltmak ve yüksek hücre sağkalım oranı için ön işlem süresini kısaltmak için tüm mesaneyi sindirmeyi önerir.
Bu yöntemi izleyerek, nöronların ve diğer hücrelerin karışık bir kültürünü elde edebiliriz. Diğer hücreler vazgeçilmezdir, çünkü varlıkları bir in vivo ortamı taklit eder11. Ek olarak, bu tür hücreler ortamda bulunmayan maddeleri sağlar.
Bu yöntem sindirim için iki adım içerir. İlk olarak, kollajen tip II, kollajeni hidroliz yapmak için kullanılır, ardından tripsin, dokuyu hücrelere dağıtmak için10. Bu şekilde, mesane dokuları tek hücrelere dağılır ve daha sonra nispeten bağımsız büyür. Nöronların kültürü olgunlaştığında, nöronlar görüntüleme veya fonksiyonel tahliller için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plaka Hazırlama
İmmünofluoresan veya kalsiyum görüntüleme deneyleri için 6, 12 veya 48 kuyulu kültür plakalarında cam kapakların kullanılması ekonomik ve örneklemsiz bir işlemdir. Hücreler, birincil hücre kültürlerinin hazırlanması sırasında kapaksız plakalarda iyi büyür. Bu nedenle, kapaklar Batı blot veya polimeraz zincir reaksiyonu gibi deneylerde dağıtılabilir. Ayrıca, kaplama, kapaklı veya kapaksız hücreleri kaplamadan önce gerekli bir adımdır. Laminin ve poli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant no. 81673676) ve Dongguan Bilim ve Teknoloji Bürosu (Grant no. 2019622101002) tarafından desteklendi. Yazarlar teknik danışmanlık için Dr. Maryrose Sullivan’a (Harvard Tıp Fakültesi Cerrahi Yardımcı Doçenti) teşekkür eder.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
