Summary
Dit protocol probeert een herhaalbaar protocol vast te stellen voor primaire neuronen en glia-isolatie van rattenblaas voor verdere cellulaire experimenten.
Abstract
De onderste urinewegen hebben twee hoofdfuncties, namelijk periodieke urineopslag en mictie; deze functies worden gemedieerd door middel van centrale en perifere neuroregulatie. Hoewel uitgebreid onderzoek naar het zenuwstelsel van de onderste urinewegen is uitgevoerd, hebben de meeste studies zich gericht op primaire cultuur. Dit protocol introduceert een methode voor de isolatie en cultuur van blaasneuronen en glia van Sprague-Dawley ratten. Bij deze methode werden de neuronen en glia gedurende 5-7 dagen geïncubeerd in een couveuse van 37 °C, 5% CO2. Als gevolg hiervan groeiden ze uit tot volwassen vormen die geschikt waren voor gerelateerde daaropvolgende immunofluorescentie-experimenten. Cellen werden morfologisch waargenomen met behulp van een optische microscoop. Neuronen, synaptische blaasjes en glia werden geïdentificeerd door respectievelijk β-III-tubuline en MAP-2, Synapsin-1 en GFAP-kleuring. Ondertussen, immunocytochemie werd uitgevoerd op verschillende neurotransmitter-gerelateerde eiwitten, zoals choline acetyltransferase, DYNLL2, en SLC17A9.
Introduction
De onderste urinewegen hebben twee hoofdfuncties: periodieke urineopslag en mictie1. Het lagere urinewegen zenuwstelsel (LUTNS) controleert deze functies en is delicaat en vatbaar voor vele neuropathieën, die aangeboren (porfyrie), verworven (ziekte van Lyme), secundair aan ziektetoestanden (diabetische cystopathie), geneesmiddel geïnduceerd (hemorragische cystitis), chirurgie veroorzaakt (abdominoperineale resectie), of letsel veroorzaakt (traumatische dwarslaesie)2,3,4,5,6,7. In fysiologische/pathologische studies zijn in vivo en in vitro experimenten even belangrijk. Hoewel in vivo onderzoek naar LUTNS al enige tijd op orgaan-, cellulair en moleculair niveau wordt uitgevoerd, is in vitro onderzoek naar primaire neuronen uit de urineblaas bijna onbestaande8,9. Hoewel de huidige studie beperkt is, hopen we het onderzoek op dit gebied te pionieren, zodat andere onderzoekers het kunnen verbeteren. Op deze manier kan deze co-cultuur leiden tot een cellulair begrip van fysiologische disfunctie in fenotypes, zoals blaasneurondisfunctie.
In tegenstelling tot enterische spieren met een duidelijke directionaliteit van de spiercellen in discrete lagen, zijn de spieren van de blaas ongeorganiseerd10. Daarom stelt deze methode voor om in plaats van de buitenste laag van de blaas af te pellen, de hele blaas te verteren om de moeilijkheidsgraad van de werking te verminderen en de voorverwerkingstijd te verkorten voor een hoge celoverlevingssnelheid.
Volgens deze methode kunnen we een gemengde cultuur van neuronen en andere cellen verkrijgen. De andere cellen zijn onmisbaar omdat hun aanwezigheid een in vivo omgeving nabootst11. Bovendien leveren dergelijke cellen de stoffen die niet beschikbaar zijn in het medium.
Deze methode omvat twee stappen voor de spijsvertering. Ten eerste wordt collagenase type II gebruikt om collageen te hydrolyseren, gevolgd door trypsine, om het weefsel te dissocieren in cellen10. Op deze manier worden blaasweefsels verspreid in enkele cellen en groeien ze vervolgens relatief onafhankelijk. Wanneer de cultuur van neuronen rijpt, kunnen de neuronen worden gebruikt voor beeldvorming of functionele assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen en dierprocedures voldeden aan de ethische principes van de Nationale Onderzoeksraad.
1. Bereiding van materialen
- Steriliseer alle instrumenten en ddH2O met behulp van een autoclaaf voordat u het experiment uitvoert. Instrumenten omvatten maar zijn niet beperkt tot chirurgische scharen, oogheelkundige scharen, tangen, lepels nucleus divider, glazen schalen (60-100 mm in diameter) en glasbrekers.
- Bereid de Krebs-oplossing als volgt voor (Tabel 1): Los alle chemicaliën voor gebruik op met ddH2O. Los CaCI2 afzonderlijk op en voeg langzaam toe aan de gemengde oplossing tijdens het roeren om sediment te voorkomen.
- Bereid de Rinse media voor, die bestaat uit F12 media met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% antibioticum/antimycoticum (100x). Voeg 5 ml FBS en 0,5 ml antibioticum/antimycoticum toe aan 44,5 ml F12-media.
- Bereid neuronmedia A voor, die neurobasale A-media bevat met 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutamine, 1% antibioticum/antimycoticum (100x) en 0,1% glia-afgeleide neurotrofe factor (GDNF). Voeg 200 μL B-27, 100 μL FBS, 100 μL L-glutamine, 100 μL antibioticum/antimycoticum (100x) en 10 μL GDNF (10 μg/ml) toe aan 9,5 ml neurobasale A-media.
OPMERKING: Bereid neuron media A binnen een week na gebruik om versheid van B-27, L-glutamine en GDNF te garanderen. - Bereid neuronmedia B voor met dezelfde procedure als de voorbereiding van neuronmedia A, maar zonder FBS toe te voegen.
- Bereid digestieoplossing 1 voor door 20 mg collagenase type II, 6 mg runderserumalbumine en 200 μL antibioticum/antimycoticum (100x) op te lossen in 10 ml zuurstofvaste Krebs-oplossing.
- Bereid digestieoplossing 2 door 1 ml 0,25% trypsine te verdunnen met 4 ml hanks uitgebalanceerde zoutoplossing.
- Bereid een bord voor met gecoate afdeklips.
- Gebruik een tang in een laminaire stromingsbank bij het plaatsen van glazen afdekplaten in een 48-put kweekplaat.
- Verdun poly-D-lysine met ddH2O tot een concentratie van 0,1 mg/ml als poly-D-lysinevoorraad. Bewaar de voorraad bij –20 °C en ontdooi voor gebruik.
- Voeg 40 μL poly-D-lysinebouillon toe bovenop elke afdeklip en incubeer de oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Stel voor verschillende platen met verschillende basale gebieden de concentratie in op 4 μg/cm2. Als het basale gebied van een put uit een 24-putplaat bijvoorbeeld 2 cm2is, moeten we 80 μL poly-D-lysinevoorraad in een put overbrengen. Elke cm2 zou 4 μg poly-D-lysine bevatten. - Verwijder poly-D-lysine in de 48-well plaat en spoel coverslips met ddH2O driemaal.
- Droog de plaat minstens 30 minuten in een laminaire stroomkap om er zeker van te zijn dat de plaat watervrij is.
- Bewaar de plaat bij 4 °C voordat u de coating 1 dag laat liggen. Het bewaren van de plaat bij −20 °C heeft de voorkeur voor langdurige opslag.
- Dooi lag bij 4 °C. Verdun lag met ddH2O tot een concentratie van 50 μg/ml als lagbouillon. Bewaar de voorraad bij –20 °C en ontdooi bij 4 °C voor gebruik.
- Gebruik een pipet om 100 μL verdunde lag over te brengen naar de bovenkant van elke deklip en incubeer laminine bij 4 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Stel voor verschillende platen met verschillende basale gebieden de concentratie in op 5 μg/cm2. Als het basale gebied van een put van een plaat met 24 putten bijvoorbeeld 2 cm2is, breng dan 200 μL verdunde lag over in een put. Elke cm2 zou 5 μg lag bevatten. - Verwijder de lagoplossing en spoel de afdeklips één keer af met ddH2O. Voer deze bewerking uit op de rand van de afdeklip om schrapen te voorkomen.
OPMERKING: Gecoate afdeklips kunnen ten hoogste 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
2. Blaasoogst
- Haal vijf weken oude Sprague-Dawley ratten.
- Giet carbogen (95% zuurstof, 5% CO2) gedurende ten minste 30 minuten in de Krebs-oplossing in een ijsbad om een stabiele zuurstofstatus en pH-niveau te bereiken.
- Na euthanasie via cervicale dislocatie, week de ratten in 75% ethanol gedurende 30 s voor sterilisatie.
- Leg ratten op een gesteriliseerde chirurgische handdoek en stel hun buik bloot. Open de buikholte en laat de blaas zien met een schaar en tang.
- Til de blaas voorzichtig op en snijd de blaas uit de blaashals met een andere set scharen en tangen om kruisbesmetting te voorkomen. Plaats de blaas snel in koude zuurstofvaste Krebs-oplossing om de celoverleving te verbeteren.
OPMERKING: Zodra de blaas is verwijderd, voert u de volgende operaties snel uit om het vooruitzicht op overleving van neuronen te verbeteren. - Voeg Krebs-oplossing toe aan drie glazen schalen en glasbrekers.
- Bereid glazen schalen en glasbrekers met Krebs-oplossing in een ijsbad voor voorkoeling.
- Markeer deze containers met de nummers 1-3 dienovereenkomstig om verwarring te voorkomen.
- Combineer elke glazen schaal met een tang en een lepels nucleus divider.
- Snijd in glazen schaal 1 de blaas open met een oogheelkundige schaar en vouw deze uit met een tang en een lepelkernverdeler.
- Spoel de blaas af in glasbreker 1 en plaats deze in glazen schaal 2.
- Elimineer aanhangend vet op het weefseloppervlak met behulp van de tang en oogheelkundige schaar in glazen schaal 2.
- Spoel de blaas af in glasbreker 2 en plaats deze in glazen schaal 3.
- Schraap de blaas voorzichtig met behulp van de tang en de lepels nucleus divider op glazen schaal 3 om exogene aanhechtingen te verwijderen.
- Spoel de blaas af in glasbreker 3, breng de blaas over in een centrifugebuis van 15 ml met 14 ml koude Krebs-oplossing en draai het monster gedurende 1 min bij 356 x g en 4 °C.
- Herhaal de vorige stap twee keer in twee andere buizen met Krebs-oplossing om verontreiniging te verminderen.
3. Tweestaps blaasvertering
- Breng de blaas over van de centrifugebuis naar een flacon van 2 ml met 1 ml spijsverteringsoplossing 1. Gebruik een oogheelkundige schaar om de blaas in kleine stukjes (kleiner dan 1 mm) in oplossing te snijden.
- Meng de blaasoplossing met 9 ml digestieoplossing 1 in een steriele celkweekschaal (100 mm in diameter). Voer stap 1-spijsvertering uit in een schudincubator gedurende 1 uur onder 5% CO2,37 °C en 200 tpm.
- Centrifugeer de oplossing na stap 1 gedurende 8 min bij 356 x g bij 4 °C.
- Plaats digestieoplossing 2 in een waterbad van 37 °C voor voorverwarmen.
- Verwijder na centrifugeren het supernatant dat digestieoplossing 1 bevat en oogst het celsediment. Wat resterende vloeistof is toegestaan. Volledige verwijdering van de oplossing kan celverlies bevorderen.
- Meng celsediment met warme verteringsoplossing 2 in een centrifugebuis van 15 ml en schud het mengsel tijdens het verteren gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C. Niet meer dan 7 minuten van stap 2 spijsvertering of neuronen zullen vergaan.
- Deactiveer na de spijsvertering trypsine onmiddellijk in het mengsel met 10 ml koude spoelmedia.
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit bij 0 °C–4 °C. Een ijsbad kan voor zo'n toestand zorgen. - Oogst het celsediment na centrifugeren bij 356 x g bij 4 °C gedurende 8 min. Verwijder zoveel mogelijk media omdat de resterende trypsine schadelijk is voor de celgroei.
- Resuspend sediment met 3 ml neuron media zachtjes. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gegenereerd in de oplossing die cellen bevat voor een hoge overlevingskans.
- Filtreer de mengselmedia door een celzeef van 70 μm in een centrifugebuis van 50 ml.
- Bewaar het filtraat op een shaker bij 30 tpm in een ijsbad gedurende 30 minuten. Deze stap is niet nodig, maar wordt aanbevolen.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 356 x g bij 4 °C gedurende 8 minuten en resuspendeer de celkorrels voorzichtig in 1 ml neuronmedia A.
- Voeg 500 μL celmengsel toe aan elke put van de voorbereide 48-well plaat.
- Kweekcellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Vervang alle media door neuron media B in 1 uur om een serumvrije kweek te bieden.
- Verander de helft van de neuron media B elke 3 dagen.
OPMERKING: Neuronen zijn klaar voor immunocytochemische experimenten na 5-7 dagen cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens het proces van primaire celkweek waren de verworven cellen rond met heldere en duidelijke grenzen vóór de bijgevoegde toestand. Naarmate de neuronen groeiden, begonnen dendrieten en axonen zich te onderscheiden. Na 5-7 dagen cultuur bereikten de neuronen een volwassen vorm met lange projecties, die ideaal waren voor beeldvorming of functiestudies. Hoewel de meeste onzuiverheden en celresten konden worden verwijderd als gevolg van veranderende media, waren bepaalde resten van poly-D-lysine en laginecoating zichtbaar (figuur 1).
Na een goede kweek konden neuronen worden geïdentificeerd via typische β-III-tubuline en MAP-2 immunostaining10,12. Bovendien werd glia specifiek geïdentificeerd via GFAP immunostaining10. Volwassen neuronen ontwikkelden synaptische stekels, die dicht bij de presynaptische specialisaties lagen die werden geïdentificeerd door de immunostaining van de synaptische eiwitmaker, synapsin-1 (Figuur 2)12. Deze resultaten gaven aan dat volwassen cellen met goed ontwikkelde synapsen via deze methode werden verkregen. Dit resultaat suggereert zijn belangrijke rol in toekomstige functiestudies.
Ondertussen werden verschillende neuronsubtypes herkend door immunocytochemie-experimenten (figuur 3). Peptiderge neuronen, die verschillende neuropeptiden bevatten, werden geïmmuneerd met stof P13. Purinergische neuronen met uitgedrukte vesiculaire nucleotidetransporters werden geïdentificeerd via SLC17A9-kleuring14. Nitrergische neuronen werden gevisualiseerd met DYNLL-2, dat nNOS verbindt met motorische eiwitten in neuronen15. Cholinerge neuronen waren immunoreactief met choline acetyltransferase16.
Figuur 1. Fasecontrastbeelden van primaire cellen geïsoleerd uit de rattenblaascultuur genomen op 1, 3 en 7 dagen na plating (respectievelijk A, B, C). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Immunofluorescentiebeelden van primaire cellen geïsoleerd uit de rattenblaas. Confocale microscopie analyse toonde neuron cytoskelet eiwitkleuring (β-III-tubuline, RRID: AB_2827688, 1:200) in primaire cultuur neuronen (A) en in hele mount blaas voorbereiding (B). In primaire cultuurneuronen werd neuronale fosfoproteïne immunostaining (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) ook gevisualiseerd (C). Glia werden geïdentificeerd via gliale fibrillaire zure eiwitkleuring (D; RRID: AB_627673, 1:50). Synapsen werden gevisualiseerd via synapsin eiwitkleuring (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) in cellulaire (E) en weefsel (F) niveaus. De secundaire gebruikte antilichamen waren als volgt: Alexa Fluor 488 (groen, geitenanti-konijn lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rood, geitenantimuis lgG, 1:200). De kern werd gevisualiseerd met Hoechst 33342 (A, C, D, E; blauw, 1 μg/ml). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Immunofluorescentiebeelden van verschillende neuronsubtypes van primaire neuronen. Peptiderge neuronen werden geïmmuneerd met stof P (A; RRID: AB_785913, 1:50). Purinergische neuronen werden geïdentificeerd via SLC17A9-kleuring (B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrergische neuronen werden gevisualiseerd via DYNLL-2 kleuring (C; AB_654147, 1:50). Cholinerge neuronen waren immunoreactief met cholineacetyltransferase (D; RRID: AB_2244867, 1:100). De secundaire gebruikte antilichamen waren als volgt: Alexa Fluor 488 (groen, geitenanti-konijn lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rood, geitenantimuis lgG, 1:200). De kern werd gevisualiseerd met Behulp van Hoechst 33342 (A, B, C, D, blauw, 1 μg/ml). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Ingrediënten | Molariteit (mM) |
| NaCI | 120 |
| KCI | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| Glucose | 11.5 |
Tabel 1. Krebs oplossing samenstelling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Voorbereiding van de plaat
Het gebruik van glasafdekkingslips in 6-, 12- of 48-putkweekplaten voor immunofluorescente of calciumbeeldvormingsexperimenten is een economische en monstersparende operatie. Cellen groeien goed in platen zonder afdeklips tijdens de bereiding van primaire celculturen. Daarom zijn coverslips overbodig in experimenten, zoals westerse vlek of polymerasekettingreactie. Bovendien is coaten een noodzakelijke stap voor het plateren van cellen, met of zonder afdeklips. Laminine en poly-D-lysine zijn veel voorkomende keuzes in coatingneuronen, met name laminine, wat essentieel is voor neurongroei17.
Mediavoorbereiding
Na de eerste mediumvervanging vereist celisolatie media zonder serum omdat serum de celdeling stimuleert en leidt tot een beperkte neuron-groeiende ruimte18. Neurongroeifactoren zijn dus cruciaal. De kwaliteit van B27 en GDNF kan grotendeels variëren van verschillende batches en grote effecten op neurongroei veroorzaken19. Daarom wordt het controleren van het lotnummer van de media aanbevolen wanneer de neuronopbrengst slecht is. Ondertussen is verse mediavoorraad cruciaal; het vereiste bedrag moet telkens vooraf worden berekend en voorbereid voordat de media worden vervangen.
Dieren
Sprague-Dawley ratten worden gebruikt in deze methode. C57BL/6 muizen zijn ook aanvaardbaar in dit experiment. Daarom kunnen ook andere stammen van ratten of muizen voor deze methode worden gebruikt, ondanks een paar variaties in morfologie en neuronale circuits. In termen van verschillende diermodellen moeten onderzoekers een geoptimaliseerd en gericht protocol ontwikkelen. Bovendien moeten jonge dieren altijd in overweging worden genomen voordat deze methode wordt toegepast.
Weefselbehandeling
Tijdens de experimenten, behalve het spijsverteringsproces, is het essentieel om weefsels op een lage temperatuur te houden om de levensvatbaarheid van cellen te verhogen, wat het celmetabolisme kan verminderen en energietekort kan voorkomen. Zuurstofniveaus, voeding en pH kunnen ook van invloed zijn op de celopbrengst11. Bovendien stellen we voor andere weefsels voor dat onderzoekers deze methode uitvoeren met aangepaste spijsverteringsconditie.
Celcultuur
Een opmerkelijk kenmerk van neuronen bij inenting is hun snelle hechting aan gecoate platen20. In dit geval wordt het veranderen van media na 1 uur cultuur aanbevolen om een hoog percentage neuronen te krijgen. Bovendien, wanneer de meeste cellen pseudopodium beginnen te groeien, kan de frequentie van veranderende media op de juiste manier worden verminderd, afhankelijk van de kleur van de media en de cellulaire toestand. Primaire celcultuur in een goede staat toont zwarte soma met een heldere rand.
De meeste zenuwcellen geïsoleerd uit de blaas zijn blaas intramurale ganglia, die bestaan uit afferent en autonome efferent innervations van de blaas13. Bovendien zijn er geen grote bekkenganglia aanwezig in het geoogste weefsel. Het verdeelt zich onder de blaashals21.
Beperking
Dit is een vooronderzoek om neuronen en glia te isoleren en te culten. Vele pogingen waren gedaan, zoals cytarabine behandeling of dichtheid gradiënt centrifugatie. Het aandeel gewenste cellen was echter nog steeds niet ideaal en er verscheen nog meer celverlies. Bovendien zullen traditionele spijsverteringsomstandigheden in dit protocol, zoals 37 °C, waarschijnlijk sommige gevoelige neurontypen doden en potentiële genexpressieartefacten veroorzaken22.
Concluderend, dit protocol biedt een methode om neuronen en glia van rattenblaas te gekweekt. De isolatie is eenvoudig te herhalen, tijdsefficiënt en gaat gepaard met minimale microbiële besmetting. Hoewel verbetering die de zuiverheid van neuronen oproept noodzakelijk is, hopen we dat deze methode bijdraagt aan LUTNS-onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen groot belangenconflict.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81673676) en Dongguan Science and Technology Bureau (Grant no. 2019622101002). De auteurs danken Dr. Maryrose Sullivan (Assistant Professor in Surgery, Harvard Medical School) voor technisch advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
