Detta protokoll försöker upprätta ett repeterbart protokoll för primära nervceller och glia isolering från råtta urinblåsan för ytterligare cellulära experiment.
Det nedre urinvägarna har två huvudfunktioner, nämligen periodisk urinlagring och micturition; dessa funktioner förmedlas genom central och perifer neuroregulation. Även om omfattande forskning om nedre urinvägarna nervsystemet har utförts, har de flesta studier fokuserat på primär kultur. Detta protokoll introducerar en metod för isolering och kultur av blåsneuroner och glia från Sprague-Dawley råttor. I denna metod inkuberades nervcellerna och glia i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 5-7 dagar. Som ett resultat växte de till mogna former som lämpar sig för relaterade efterföljande immunofluorescens experiment. Cellerna observerades morfologiskt med hjälp av ett optiskt mikroskop. Nervceller, synaptiska vesiklar och glia identifierades av β-III-tubulin och MAP-2, Synapsin-1 och GFAP färgning, respektive. Under tiden utfördes immunocytochemistry på flera signalsubstans-relaterade proteiner, såsom kolin acetyltransferase, DYNLL2 och SLC17A9.
Nedre urinvägarna har två huvudfunktioner: periodisk urinlagring och micturition1. Nedre urinvägarna nervsystemet (LUTNS) kontrollerar dessa funktioner och är känsliga och mottagliga för många neuropathies, som kan vara medfödda (porfyri), förvärvat (Lyme sjukdom), sekundärt till sjukdom stater (diabetiker cystopati), drog inducerad (hemorragisk cystit), kirurgi orsakad (abdominoperin samband), eller skada orsakad (traumatisk ryggmärgsskada)2,3,4,5,6,7. I fysiologiska/patologiska studier är in vivo- och in vitro-experiment lika viktiga. Medan in vivo-forskning om LUTNS har utförts på organ-, cellulära och molekylära nivåer under en tid, är in vitro-forskning om primära nervceller från urinblåsan nästan obefintlig8,9. Även om den nuvarande studien är begränsad hoppas vi kunna bana väg för forskning på detta område så att andra forskare kan förbättra den. På detta sätt kan denna samkultur leda till en cellulär förståelse av fysiologisk dysfunktion i fenotyper, såsom urinblåsan neuron dysfunktion.
I motsats till enteriska muskler med en tydlig riktning av muskelcellerna i diskreta lager är urinblåsans muskler oorganiserade10. Därför föreslår denna metod, istället för att skala av urinblåsans yttre skikt, att smälta hela blåsan för att minska svårigheten att fungera och förkorta förbearbetningstiden för en hög cellöverlevnad.
Enligt denna metod kan vi få en blandad kultur av nervceller och andra celler. De andra cellerna är oumbärliga eftersom deras närvaro efterliknar en in vivo-miljö11. Dessutom ger sådana celler de ämnen som inte är tillgängliga i mediet.
Denna metod innebär två steg för matsmältningen. För det första används kollagen typ II för att hydrolysera kollagen, följt av trypsin, för att skilja vävnaden icellerna 10. På detta sätt sprids blåsvävnader till enstaka celler och växer sedan relativt oberoende. När neuronkulturen mognar kan nervcellerna användas för avbildning eller funktionella analyser.
Förberedelse av tallrikar
Användningen av glasöverdrag i 6-, 12- eller 48-brunns odlingsplattor för immunofluorescerande eller kalciumavbildningsexperiment är en ekonomisk och provskonskonande operation. Celler växer bra i tallrikar utan täcken under beredningen av primära cellkulturer. Därför är täcklips dispenserbara i experiment, såsom western blot eller polymeraskedjereaktion. Dessutom är beläggning ett nödvändigt steg före plätering av celler, med eller utan täcken. Laminin oc…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81673676) och Dongguan Science and Technology Bureau (Anslag nr 2019622101002). Författarna tackar Dr. Maryrose Sullivan (biträdande professor i kirurgi, Harvard Medical School) för teknisk rådgivning.
0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |