Isolering och kultur av primära nervceller och Glia från vuxen råtta urinblåsa
Summary
Detta protokoll försöker upprätta ett repeterbart protokoll för primära nervceller och glia isolering från råtta urinblåsan för ytterligare cellulära experiment.
Abstract
Det nedre urinvägarna har två huvudfunktioner, nämligen periodisk urinlagring och micturition; dessa funktioner förmedlas genom central och perifer neuroregulation. Även om omfattande forskning om nedre urinvägarna nervsystemet har utförts, har de flesta studier fokuserat på primär kultur. Detta protokoll introducerar en metod för isolering och kultur av blåsneuroner och glia från Sprague-Dawley råttor. I denna metod inkuberades nervcellerna och glia i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 5-7 dagar. Som ett resultat växte de till mogna former som lämpar sig för relaterade efterföljande immunofluorescens experiment. Cellerna observerades morfologiskt med hjälp av ett optiskt mikroskop. Nervceller, synaptiska vesiklar och glia identifierades av β-III-tubulin och MAP-2, Synapsin-1 och GFAP färgning, respektive. Under tiden utfördes immunocytochemistry på flera signalsubstans-relaterade proteiner, såsom kolin acetyltransferase, DYNLL2 och SLC17A9.
Introduction
Nedre urinvägarna har två huvudfunktioner: periodisk urinlagring och micturition1. Nedre urinvägarna nervsystemet (LUTNS) kontrollerar dessa funktioner och är känsliga och mottagliga för många neuropathies, som kan vara medfödda (porfyri), förvärvat (Lyme sjukdom), sekundärt till sjukdom stater (diabetiker cystopati), drog inducerad (hemorragisk cystit), kirurgi orsakad (abdominoperin samband), eller skada orsakad (traumatisk ryggmärgsskada)2,3,4,5,6,7. I fysiologiska/patologiska studier är in vivo- och in vitro-experiment lika viktiga. Medan in vivo-forskning om LUTNS har utförts på organ-, cellulära och molekylära nivåer under en tid, är in vitro-forskning om primära nervceller från urinblåsan nästan obefintlig8,9. Även om den nuvarande studien är begränsad hoppas vi kunna bana väg för forskning på detta område så att andra forskare kan förbättra den. På detta sätt kan denna samkultur leda till en cellulär förståelse av fysiologisk dysfunktion i fenotyper, såsom urinblåsan neuron dysfunktion.
I motsats till enteriska muskler med en tydlig riktning av muskelcellerna i diskreta lager är urinblåsans muskler oorganiserade10. Därför föreslår denna metod, istället för att skala av urinblåsans yttre skikt, att smälta hela blåsan för att minska svårigheten att fungera och förkorta förbearbetningstiden för en hög cellöverlevnad.
Enligt denna metod kan vi få en blandad kultur av nervceller och andra celler. De andra cellerna är oumbärliga eftersom deras närvaro efterliknar en in vivo-miljö11. Dessutom ger sådana celler de ämnen som inte är tillgängliga i mediet.
Denna metod innebär två steg för matsmältningen. För det första används kollagen typ II för att hydrolysera kollagen, följt av trypsin, för att skilja vävnaden icellerna 10. På detta sätt sprids blåsvävnader till enstaka celler och växer sedan relativt oberoende. När neuronkulturen mognar kan nervcellerna användas för avbildning eller funktionella analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förberedelse av tallrikar
Användningen av glasöverdrag i 6-, 12- eller 48-brunns odlingsplattor för immunofluorescerande eller kalciumavbildningsexperiment är en ekonomisk och provskonskonande operation. Celler växer bra i tallrikar utan täcken under beredningen av primära cellkulturer. Därför är täcklips dispenserbara i experiment, såsom western blot eller polymeraskedjereaktion. Dessutom är beläggning ett nödvändigt steg före plätering av celler, med eller utan täcken. Laminin oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81673676) och Dongguan Science and Technology Bureau (Anslag nr 2019622101002). Författarna tackar Dr. Maryrose Sullivan (biträdande professor i kirurgi, Harvard Medical School) för teknisk rådgivning.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
