वयस्क चूहा मूत्राशय से प्राथमिक न्यूरॉन्स और ग्लिया की अलगाव और संस्कृति
Summary
यह प्रोटोकॉल प्राथमिक न्यूरॉन्स और आगे सेलुलर प्रयोगों के लिए चूहा मूत्राशय से ग्लिया अलगाव के लिए एक दोहराने योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करने का प्रयास करता है।
Abstract
निचले मूत्र पथ में दो मुख्य कार्य होते हैं, अर्थात् आवधिक मूत्र भंडारण और मिक्चरिशन; इन कार्यों को केंद्रीय और परिधीय न्यूरोरेगुलेशन के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है। हालांकि निचले मूत्र पथ तंत्रिका तंत्र पर व्यापक शोध किया गया है, ज्यादातर अध्ययनों प्राथमिक संस्कृति पर ध्यान केंद्रित किया है । यह प्रोटोकॉल स्प्राग-डावले चूहों से मूत्राशय न्यूरॉन्स और ग्लिया के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का परिचय देता है। इस विधि में, न्यूरॉन्स और ग्लिया को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर को 5-7 दिनों तक इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटेड किया गया था। नतीजतन, वे संबंधित बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए उपयुक्त परिपक्व आकार में वृद्धि हुई। कोशिकाओं को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रूपात्मक रूप से देखा गया था। न्यूरॉन्स, सिनैप्टिक वेसिकल्स और ग्लिया की पहचान क्रमशः β-III-ट्यूबलिन और एमएपी-2, सिनैप्सिन-1 और जीएफएपी स्टेनिंग द्वारा की गई थी । इस बीच, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री कई न्यूरोट्रांसमीटर से संबंधित प्रोटीन, जैसे कोलीन एसीटिलट्रांसफरेज, DYNLL2, और SLC17A9 पर किया गया था ।
Introduction
निचले मूत्र पथ में दो मुख्य कार्य होते हैं: आवधिक मूत्र भंडारण और मिक्चरिशन1। निचला मूत्र पथ तंत्रिका तंत्र (LUTNS) इन कार्यों को नियंत्रित करता है और कई न्यूरोपैथी के लिए नाजुक और अतिसंवेदनशील होता है, जो जन्मजात (पोर्फिरिया), अधिग्रहीत (लाइम रोग), माध्यमिक से रोग राज्यों (मधुमेह सिस्टोपैथी), दवा प्रेरित (रक्तस्रावी सिस्टिटिस), सर्जरी के कारण (एब्डोमिनोपिनियल रीसेक्शन), या चोट के कारण (दर्दनाक रीढ़ की हड्डी की चोट)2,3,4,5,6, 7हो सकती है। शारीरिक/रोग अध्ययनों में, वीवो में और इन विट्रो प्रयोग समान रूप से महत्वपूर्ण हैं । जबकि LUTNS पर वीवो अनुसंधान में कुछ समय के लिए अंग, सेलुलर, और आणविक स्तर पर आयोजित किया गया है, मूत्राशय से प्राथमिक न्यूरॉन्स पर इन विट्रो अनुसंधान लगभग अस्तित्वहीन8,9है । हालांकि वर्तमान अध्ययन सीमित है, हम इस क्षेत्र में अग्रणी अनुसंधान की उम्मीद है ताकि अन्य शोधकर्ताओं ने इसे बेहतर बना सकते हैं। इस तरीके से, इस सह-संस्कृति से फेनोटाइप में शारीरिक शिथिलता की सेलुलर समझ हो सकती है, जैसे मूत्राशय न्यूरॉन डिसफंक्शन।
मांसपेशियों की कोशिकाओं की स्पष्ट दिशात्मकता के साथ आंत्र मांसपेशियों के विपरीत असतत परतों में, मूत्राशय की मांसपेशियां असंगठित10हैं। इसलिए, मूत्राशय की बाहरी परत को छीलने के बजाय, इस विधि में ऑपरेशन की कठिनाई को कम करने और उच्च सेल जीवित रहने की दर के लिए प्रीप्रोसेसिंग समय को छोटा करने के लिए पूरे मूत्राशय को पचाने का प्रस्ताव है।
इस विधि के बाद, हम न्यूरॉन्स और अन्य कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृति प्राप्त कर सकते हैं। अन्य कोशिकाएं अपरिहार्य हैं क्योंकि उनकी उपस्थिति वीवो वातावरण में एक की नकल करती है11. इसके अलावा ऐसी कोशिकाएं ऐसे पदार्थ उपलब्ध कराती हैं जो माध्यम में अनुपलब्ध हैं।
इस विधि में पाचन के लिए दो कदम शामिल हैं। सबसे पहले, कोलेजने प्रकार II का उपयोग हाइड्रोलाइज कोलेजन के लिए किया जाता है, इसके बाद ट्राइप्सिन द्वारा ऊतक को कोशिकाओं में अलग करने के लिए10। इस तरीके से, मूत्राशय के ऊतकों को एकल कोशिकाओं में फैलाया जाता है और फिर अपेक्षाकृत स्वतंत्र हो जाता है। जब न्यूरॉन्स की संस्कृति परिपक्व होती है, तो न्यूरॉन्स का उपयोग इमेजिंग या कार्यात्मक परख के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लेट तैयार करना
इम्यूनोफ्लोरेसेंट या कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए 6-, 12-, या 48-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में ग्लास कवरस्लिप का उपयोग एक किफायती और नमूना-बख्शते ऑपरेशन है। कोशिकाएं प्राथ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 81673676) और डोंगगुआन साइंस एंड टेक्नोलॉजी ब्यूरो (ग्रांट नंबर 2019622101002) ने सपोर्ट किया। लेखक तकनीकी परामर्श के लिए डॉ मैरीरोज सुलिवान (सर्जरी में सहायक प्रोफेसर, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
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