Isolasjon og kultur av primære nevroner og glia fra voksen rotte urinblære
Summary
Denne protokollen forsøker å etablere en repeterbar protokoll for primære nevroner og gliaisolasjon fra rotteblære for ytterligere cellulære eksperimenter.
Abstract
Den nedre urinveiene har to hovedfunksjoner, nemlig periodisk urinlagring og micturition; Disse funksjonene formidles gjennom sentral og perifer nevroregulering. Selv om det er forsket mye på nedre urinveisnervesystem, har de fleste studier fokusert på primærkultur. Denne protokollen introduserer en metode for isolasjon og kultur av blæren nevroner og glia fra Sprague-Dawley rotter. I denne metoden ble nevronene og glia inkubert i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator i 5–7 dager. Som et resultat vokste de til modne former egnet for relaterte etterfølgende immunfluorescence eksperimenter. Celler ble morfologisk observert ved hjelp av et optisk mikroskop. Nevroner, synaptiske vesikler og glia ble identifisert av henholdsvis β-III-tubulin og MAP-2, Synapsin-1 og GFAP-farging. I mellomtiden ble immunocytokjemi utført på flere nevrotransmitterrelaterte proteiner, for eksempel kolin acetyltransferase, DYNLL2 og SLC17A9.
Introduction
Den nedre urinveiene har to hovedfunksjoner: periodisk urinlagring og micturition1. Det nedre urinveisnervesystemet (LUTNS) styrer disse funksjonene og er delikat og utsatt for mange nevropatier, som kan være medfødt (porfyri), ervervet (Lyme sykdom), sekundært til sykdomstilstander (diabetisk cystopati), indusert legemiddel (hemorragisk cystitis), kirurgi forårsaket (abdominoperineal reseksjon), eller skade forårsaket (traumatisk ryggmargsskade)2,3,4,5,6,7. I fysiologiske/patologiske studier er in vivo- og in vitro-eksperimenter like viktige. Mens in vivo forskning på LUTNS har blitt utført på organ-, cellulære og molekylære nivåer i noen tid, in vitro forskning på primære nevroner fra urinblæren er nesten ikke-eksisterende8,9. Selv om den nåværende studien er begrenset, håper vi å pionerforskningen på dette området slik at andre forskere kan forbedre den. På denne måten kan denne samkulturen føre til en cellulær forståelse av fysiologisk dysfunksjon i fenotyper, for eksempel blære nevron dysfunksjon.
I motsetning til enteriske muskler med en klar retning av muskelcellene i diskrete lag, er blærens muskler uorganiserte10. Derfor, i stedet for å skrelle av blærens ytre lag, foreslår denne metoden å fordøye hele blæren for å redusere vanskeligheten med drift og forkorte forbehandlingstiden for en høy celleoverlevelsesrate.
Etter denne metoden kan vi oppnå en blandet kultur av nevroner og andre celler. De andre cellene er uunnværlige fordi deres tilstedeværelse etterligner et in vivo-miljø11. I tillegg gir slike celler stoffene som ikke er tilgjengelige i mediet.
Denne metoden innebærer to trinn for fordøyelsen. For det første brukes kollagen type II til å hydrolysere kollagen, etterfulgt av trypsin, for å dissosiere vevet i celle10. På denne måten spres blærevev i enkeltceller og vokser deretter relativt uavhengig. Når kulturen av nevroner modnes, kan nevronene brukes til avbildning eller funksjonelle analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plate forberedelse
Bruk av glassdeksler i 6-, 12- eller 48-brønns kulturplater for immunfluoreserende eller kalsiumavbildningseksperimenter er en økonomisk og prøvesparende operasjon. Celler vokser godt i plater uten deksler under utarbeidelsen av primærcellekulturer. Derfor er deksler dispenserbare i eksperimenter, for eksempel vestlig blotter eller polymerasekjedereaksjon. Videre er belegg et nødvendig skritt før plating celler, med eller uten deksler. Laminin og poly-D-lysin er vanlige valg i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81673676) og Dongguan Science and Technology Bureau (Grant no. 2019622101002). Forfatterne takker Dr. Maryrose Sullivan (universitetslektor i kirurgi, Harvard Medical School) for teknisk rådgivning.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
