Hier wordt een methode gepresenteerd voor onderzoek naar de rollen van de Na+ /K+ pomp en persistente Na+ stroom in bloedzuiger hart interneuronen met behulp van dynamische klem.
De Na+/K+ pomp, vaak beschouwd als een achtergrondfunctie in neuronale activiteit, draagt bij aan een uitgaande stroom (Ipomp) die reageert op de interne concentratie van Na+ ([Na+]i). In barstende neuronen, zoals die gevonden in centrale patroongenerator (CPG) neuronale netwerken die ritmische bewegingen produceren, kan worden verwacht dat de [Na+]i en dus de I-pomp, gedurende de burst-cyclus variëren. Deze reactie op elektrische activiteit, gecombineerd met onafhankelijkheid van membraanpotentiaal, geeft deI-pomp dynamische eigenschappen die niet gebruikelijk zijn voor kanaalgebaseerde stromen (bijv. spannings- of zender-gated of lekkanalen). Bovendien wordt in veel neuronen de activiteit van de pomp gemoduleerd door een verscheidenheid aan modulatoren, waardoor de potentiële rol van I-pomp in ritmische barstactiviteit verder wordt uitgebreid. Dit artikel laat zien hoe een combinatie van modellering en dynamische klemmethoden kan worden gebruikt om te bepalen hoe ikpomp en de interactie met persistente Na+ stroom de ritmische activiteit in een CPG beïnvloeden. Specifiek zal dit artikel zich richten op een dynamisch klemprotocol en computationele modelleringsmethoden in hart-interneuronen van medicinale bloedzuigers.
Heartbeat in bloedzuigers wordt aangedreven door een CPG bestaande uit 9 bilaterale paren van hart interneuronen (HNs) verdeeld over evenveel mid-body segmentale ganglia. In de kern van de CPG bevinden zich wederzijds remmende paren van interneuronen in de3e en4e segmentale ganglia die half-center oscillatoren (HCO’s) vormen (Figuur 1A). Deze neuronen blijven barsten wanneer synaptisch farmacologisch wordt geïsoleerd met behulp van bicuculline1. Anderen, zoals het paar in de7e segmentale ganglia (de focus van dit protocol), zijn ook bursters, in staat om barstactiviteit te produceren wanneer synaptisch geïsoleerd. Ze zijn niet onderling verbonden en ontvangen alleen dalende input en kunnen dus gemakkelijk worden geïsoleerd door het ganglion van de rest van de zenuwstreng af te snijden. Deze onafhankelijke barstactiviteit is gevoelig voor geïntroduceerde lekstroom veroorzaakt door penetratie met scherpe micro-elektroden voor opname, maar krachtig barsten wanneer opgenomen met losse patchmethoden1.
Zowel individuele HN-neuronen als HN-HCO’s zijn gemodelleerd (Hodgkin-Huxley-gebaseerde enkele isopotentiële compartimentmodellen van HN-neuronen die alle experimenteel geïdentificeerde spannings-gated en synaptische stromen bevatten), en alle burst-kenmerken van het levende systeem zijn met succes vastgelegd2. Myomoduline, een endogene neuropeptide in bloedzuigers, vermindert duidelijk de periode (T) van het burst-ritme van geïsoleerde HN-neuronen en HN-HCO’s. Deze modulator werkt om de h-stroom te verhogen (hyperpolarisatie-geactiveerde inwaartse stroom, Ih) en om Ipomp3te verlagen . Deze observatie leidde tot de verkenning van hoe ikpomp interageert met Ih, en hoe hun co-modulatie bijdraagt aan de ritmische activiteit van HN-neuronen. Activering van de pomp door het verhogen van [Na+]i (met behulp van de ionofoor monensin) versnelt het HN-barstritme in zowel HN-HCO’s als geïsoleerde HN-neuronen4. Deze versnelling was afhankelijk van Ih. Toen Ih werd geblokkeerd (2 mM Cs+), werd de barstperiode niet gewijzigd door deze methode van pompactivering; de burstduur (BD) werd echter ingeperkt en het interburstinterval (IBI) nam toe in zowel HN-HCO’s als geïsoleerde HN-neuronen4.
Voor dit protocol zijn alle stromen van een levend HN(7)-neuron, inclusief de pompstroom, I-pomp, als volgt in het HN-model opgenomen:
(1)
waarbij C de membraancapaciteit is (in nF), V de membraanpotentiaal (in V), t tijd (in s). Gedetailleerde ionische stroombeschrijvingen en vergelijkingen zijn elders beschreven2,4. Het volledige HN-modelneuron draait in real time(figuur 2). De software zal na publicatie beschikbaar worden gesteld op GitHub en zal geschikt zijn om te draaien op de digitale signaalverwerkingskaartdie wordt beschreven in de Tabel met Materialen . Hier is de focus van het onderzoek de Na+/ K+ pompstroom(Ipomp)en de spanningsgepoorte stromen die een significante Na+ flux bijdragen: een snelle Na+ stroom (INa) en een aanhoudende Na+ stroom (IP). De maximale geleidingen van deze stromen zijn
respectievelijk. De Na+/K+ pomp wisselt drie intracellulaire Na+ ionen uit voor twee extracellulaire K+ ionen, waardoor een netto uitgaande stroom ontstaat. Belangrijk is dat het 3 keer zoveel Na+ uit het neuron pompt als deze stroom aangeeft, wat belangrijk is voor het berekenen van de intracellulaire Na+ -concentratie.
De Na+/K+ pompstroom is afhankelijk van intracellulaire Na+ concentraties en wordt uitgedrukt door de volgende sigmoïdale functie:
(2)
waarbij [Na]i de intracellulaire Na+ concentratie is, de maximale Na+/K+ pompstroom, [Na]ih de intracellulaire Na+ concentratie is voor de halve activering van de Na+/ K+ pomp, en [Na] de gevoeligheid is van de Na+/ K+ pomp tot [Na]i. [Na]i bouwt als gevolg van de Na+ instroom gedragen door IP en INa en wordt verminderd door de Na+ efflux van de Na+ /K+ pomp. De bijdrage van Ih en ILeak aan de totale Na+ flux is klein en wordt niet meegenomen in het real-time model.
(3)
waarbij v het volume (~6,7 pL) van het intracellulaireNa+ reservoir is, F de constante van Faraday en de extracellulaire Na+ concentratie constant wordt gehouden.
Spannings- en lekgeleidingen zijn gedifferentieerd – deze reageren op membraanpotentiaal – van de pompstroom, die wordt geregeld door de berekende intracellulaire Na+ -concentratie ([Na+]i). [Na+] i wordt opgebouwd via Na+ entry via de snelle Na+ stroom (INa) die actiepotentiaalen (spikes) produceert en de aanhoudende Na+ stroom (IP) die de depolarisatie biedt om spiking te ondersteunen. [Na+] i wordt op zijn beurt verminderd door de werking van de pomp door de extrusie van Na+. Baseline levende HN-waarden van (5nS) en
(150 nS) zijn aangenomen en we houden rekening met eventuele toegevoegde dynamische klem
.
Het doel van het hier beschreven protocol is om I-pomp nauwkeurig en omkeerbaar in realtime te manipuleren om te ontdekken hoe het interageert met voltage-gated stromen (persistente Na+ stroom in het huidige protocol) om ritmische bursting in enkele HNs te regelen. Om dit doel te bereiken, werd een dynamische klem gebruikt, die op commando kunstmatig een precieze hoeveelheid van elke stroom introduceert die kan worden berekend terwijl het model draait. Deze methode heeft voordelen ten opzichte van farmacologische manipulatie van de pomp, die het hele weefsel beïnvloedt, off-target effecten kan hebben die vaak moeilijk terug te draaien zijn en niet precies kunnen worden gemanipuleerd. Dynamische klem5,6 leest de spanning van een opgenomen neuron in real time(Figuur 1B)en berekent en injecteert, in real time, de hoeveelheid stroom op basis van modelvergelijkingen en de ingestelde waarden van een of
. Vergelijkbare methoden kunnen gemakkelijk worden toegepast op elk neuron dat intracellulair kan worden geregistreerd. Parameters moeten echter worden aangepast aan het gekozen neuron en het neuron moet worden geïsoleerd uit synaptische inputs, bijvoorbeeld farmacologisch.
Modellering, dynamische klem en de resulterende analyses die ze mogelijk maken, zijn nuttige technieken om te onderzoeken hoe individuele en groepen ionische geleiding / stromen bijdragen aan de elektrische activiteit van neuronen(figuur 1, figuur 2,figuur 4en figuur 5). Het gebruik van deze technieken laat zien hoe de Na+/ K+ pompstroom(I-pomp)interageert met spannings-gated stromen, met name de persistente Na+ stroom (IP), om robuuste barsten in de kern-HNs van de bloedzuigerhartslagpatroongenerator te bevorderen. Door dynamische klemexperimenten en modellering te combineren, is het mogelijk om modellen directer te testen dan mogelijk is met gewone spanningsregistratie en stroomklemtechnieken. De resultaten van de dynamische klemexperimenten (figuur 5) zullen worden gebruikt om het HN-model verder te verfijnen. De hier gedemonstreerde basismethode van dynamisch klemmen kan worden aangepast om de eigenschappen van elk neuron dat wordt bestudeerd weer te geven als een wiskundig model van neuronale stromen kan worden bepaald met spanningsklemexperimenten.
Succesvolle voltooiing van de experimenten van het hier getoonde type vereist een zorgvuldige impalement van een HN of ander neuron bij gebruik van een scherpe micro-elektrode, omdat sterke barsten wordt beperkt door elektrodepenetratie1. (Whole-cell patch recording technieken, die geïntroduceerde lekkage minimaliseren, zijn ook van toepassing op andere neuronen, maar werken niet goed op bloedzuigerneuronen.) Het is van cruciaal belang dat de impalement van het HN-neuron minimale schade aan het neuron veroorzaakt (toegevoegd lek), en de ingangsweerstand moet worden bewaakt en moet in het bereik van 60-100 MOhms liggen voor succesvolle experimenten4.
Dynamische klem is een krachtige techniek, maar het heeft beperkingen opgelegd door neuronale geometrie omdat de kunstmatige geleidingen worden geïmplementeerd op de plaats van de opname-elektrode – meestal het cellichaam – niet op de plaats waar ritmegenererende stromen meestal worden gelokaliseerd5,6,10. In bloedzuiger HN-neuronen bevindt het cellichaam zich elektrisch dicht bij de integratiezone (hoofdneuriet) van het neuron waar de meeste actieve stromen zijn gelokaliseerd en pieken worden geïnitieerd.
The authors have nothing to disclose.
We danken Christian Erxleben voor voorlopige dynamische klemexperimenten op HN(7)-neuronen die hun barstvermogen hebben aangetoond. Angela Wenning hielp de experimenten met deskundig advies. We erkennen de NIH voor de financiering van dit werk via Grant 1 R21 NS111355 aan GSC en RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |