Burada sunulan dinamik kelepçe kullanarak sülük kalp internöronlarında Na+/ K+ pompa ve kalıcı Na+ akımı rollerinin araştırılması için bir yöntemdir.
Genellikle nöronal aktivitede bir arka plan işlevi olarak düşünülen Na+/ K+ pompası, Na + ([Na+ ] i) iç konsantrasyonuna yanıt veren bir dışa doğru akıma(pompalarım)katkıda bulunur. Ritmik hareketler üreten merkezi desen jeneratörü (CPG) nöronal ağlarında bulunanlar gibi patlayan nöronlarda, [Na+]i ve dolayısıyla Ipompası, patlama döngüsü boyunca değişebilir. Elektriksel aktiviteye bu yanıt verme, membran potansiyelinden bağımsızlık ile birlikte, kanal tabanlı akımlarda (örneğin, voltaj veya verici kapılı veya sızıntı kanalları) yaygın olmayan dinamik özelliklere sahip pompayı armatöre eder. Ayrıca, birçok nöronda, pompanın aktivitesi çeşitli modülatörler tarafından modüle edilir ve ritmik patlama aktivitesinde pompalamanın potansiyel rolünü daha da genişletir. Bu makale, bir CPG’deki kalıcı Na+ akım etkisi ritmik aktivitesi ile etkileşimini ve pompalama şeklimi belirlemek için modelleme ve dinamik kelepçe yöntemlerinin bir kombinasyonunun nasıl kullanılacağını göstermektedir. Özellikle, bu makale tıbbi sülüklerin kalp internöronlarında dinamik bir kelepçe protokolüne ve hesaplamalı modelleme yöntemlerine odaklanacaktır.
Sülüklerdeki kalp atışı, birçok orta vücut segmental gangliyona dağılmış 9 çift kalp internörüsünden (HN) oluşan bir CPG tarafından tahrik edilir. CPG’nin özünde, yarı merkez osilatörleri (HCO’ lar) oluşturan 3rd ve4. segmental gangliyonlarda bulunan internöronların karşılıklı inhibitör çiftleri vardır (Şekil 1A). Bu nöronlar, bikükülin1kullanılarak sinaptik olarak farmakolojik olarak izole edildiğinde patlamaya devam eder. 7. segmental gangliyondaki çift (bu protokolün odak noktası) gibi diğerleri de sinaptik olarak izole edildiğinde patlama aktivitesi üretebilen patlamacılardır. Karşılıklı olarak bağlanmazlar ve sadece alçalan girdileri alırlar ve böylece ganglionu sinir kordonunun geri kalanından kopararak kolayca izole edilirler. Bu bağımsız patlama aktivitesi, kayıt için keskin mikroelekrodlarla penetrasyondan kaynaklanan girişli sızıntı akımına duyarlıdır, ancak gevşek yama yöntemleriyle kaydedildiğinde güçlü bir şekilde patlar1.
Hem bireysel HN nöronları hem de HN HCO’lar modellenmiştir (deneysel olarak tanımlanmış tüm voltaj kapılı ve sinaptik akımları içeren HN nöronlarının Hodgkin-Huxley tabanlı tek izopotential bölme modelleri) ve canlı sistemin tüm patlama özellikleri başarıyla yakalanmıştır2. Sülüklerde endojen bir nöropeptid olan Myomodulin, izole edilmiş HN nöronlarının ve HN HCO’ların patlama ritminin (T) süresini belirgin bir şekilde azaltır. Bu modülatör h akımını (hiperpolarizasyonla aktive edilen içe akım, Ih)artırmak ve Ipompayıazaltmak için3. Bu gözlem, pompalamanın I hile nasıl etkileşime girdiğini ve birlikte modülasyonlarının HN nöronlarının ritmik aktivitesine nasıl katkıda bulunduğunu keşfetmeye yol açtı. Pompanın [Na +]i (iyonofor monensin kullanılarak) artırılarak aktivasyonu, hem HN HCO’larda hem de izole HN nöronlarında HN patlama ritmini hızlandırır4. Bu hız i h’ye bağlıydı. bununla birlikte, patlama süresi (BD) kısıtlandı ve hem HN HCO’larda hem de izole HN nöronlarında iç patlama aralığı (IBI)arttı 4.
Bu protokol için, pompa akımı, Ipompa dahil olmak üzere yaşayan bir HN(7) nöronunun tüm akımları HN modeline aşağıdaki gibi dahil edilir:
(1)
burada C membran kapasitansıdır (nF’de), V membran potansiyelidir (V’de), t zamandır (ins). Ayrıntılı iyonik akım açıklamaları ve denklemleri başka bir yerde açıklanmıştır2,4. HN modelinin tamamı nöron gerçek zamanlı olarak çalışır(Şekil 2). Yazılım yayınlandıktan sonra GitHub’da kullanıma sunulacak ve Malzeme Tablosu‘nda açıklanan dijital sinyal işleme panosunda çalıştırılacaktır. Burada, sorgulamanın odak noktası Na+/ K+ pompa akımı (Ipompa) ve önemli Na+ akı katkıda bulunan voltaj kapılı akımlardır: hızlı bir Na+ akımı (INa) ve kalıcı bir Na+ akımı (IP). Bu akımların maksimum iletkenlikleri
sırasıyladır. Na+/ K+ pompası, iki hücre dışı K+ iyon için üç hücre içi Na+ iyon değiştirir, böylece net bir dış akım üretir. Daha da önemlisi, bu akımın gösterdiğinden 3 kat daha fazla Na+ pompalar, bu da hücre içi Na+ konsantrasyonunun hesaplanması için önemlidir.
Na+/ K+ pompa akımı hücre içi Na+ konsantrasyonlarına bağlıdır ve aşağıdaki sigmoidal fonksiyonla ifade edilir:
(2)
burada [Na]i hücre içi Na+ konsantrasyonudur, maksimal Na+/ K+ pompa akımıdır, [Na]ih, Na + / K+ pompanın yarı aktivasyonu için hücre içi Na+konsantrasyonudur ve [Na] Na + / K +pompasının [Na]i’ye duyarlılığıdır. I P ve INa tarafından taşınan Na+ akınlarının bir sonucu olarak inşa edilir ve Na + /K + pompanın Na+efflux’ı tarafından azalır. Ih ve ILeak’in toplam Na+ akı katkısı küçüktür ve gerçek zamanlı modelde dikkate alınmaz.
(3)
burada, v hücre içi Na+ rezervuarın hacmidir (~6.7 pL), F Faraday’ın sabitidir ve hücre dışı Na+ konsantrasyonu sabit tutulur.
Gerilim kapılı ve sızıntı iletkenlikleri ayırt edilmiştir-bunlar membran potansiyeline yanıt verir – hesaplanan hücre içi Na + konsantrasyonu([Na+ ]i)tarafından düzenlenen pompa akımından. [Na+] i, aksiyon potansiyelleri (sivri) ve spiking’i desteklemek için depolarizasyon sağlayan kalıcı Na+ akımı(IP)üreten hızlı Na + akımı ( I Na ) aracılığıyla Na+ girişi aracılığıyla oluşturulmuştır. [Na+] i, sırayla, Na+ekstrüzyonu yoluyla pompanın etkisi ile azaltılır. (5nS) ve
(150 nS) temel yaşam HN değerleri varsayılmıştır ve herhangi bir ilave dinamik kelepçeyi dikkate
alıyoruz.
Burada açıklanan protokolün amacı, tek HN’lerde ritmik patlamayı kontrol etmek için voltaj kapılı akımlarla (mevcut protokoldeki kalıcı Na+ akım) nasıl etkileşime girdiğini keşfetmek için gerçek zamanlı olarak tam ve geri dönüşümlü olarak pompalamamı manipüle etmektir. Bu hedefe ulaşmak için, komut üzerine, model çalışırken hesaplanabilecek herhangi bir akımın kesin bir miktarını yapay olarak tanıtan dinamik kelepçe kullanıldı. Bu yöntem, tüm dokuyu etkileyen, genellikle tersine çevrililmesi zor olan ve tam olarak manipüle edilemeyen hedef dışı etkilere sahip olabilen pompanın farmakolojik manipülasyonu üzerinde avantajlara sahiptir. Dinamik kelepçe5,6 kaydedilen bir nöronun voltajını gerçek zamanlı olarak okur (Şekil 1B) ve model denklemlerine ve herhangi bir veya herhangi bir veya herhangi bir değerine dayalı herhangi bir akımın miktarını hesaplar ve enjekte
eder. Benzer yöntemler hücre içi olarak kaydedilebilen herhangi bir nörona kolayca uygulanabilir. Bununla birlikte, parametrelerin seçilen nörona yeniden ölçeklendirilmesi ve nöronun sinapik girdilerden izole edilmesi gerekir, örneğin farmakolojik olarak.
Modelleme, dinamik kelepçe ve bunların sağladığı analizler, bireysel ve iyonik iletkenlik/akım gruplarının nöronların elektriksel aktivitesine nasıl katkıda bulunduğunu keşfetmek için yararlı tekniklerdir (Şekil 1, Şekil 2,Şekil 4ve Şekil 5). Bu tekniklerin kullanımı, Sülük kalp atışı desen jeneratörünün çekirdek HN’lerinde sağlam patlamayı teşvik etmek için Na+/K + pompa akımının(pompa)voltaj kapılı akımlarla, özellikle kalıcı Na + akımıyla(IP)nasıl etkileşime girdiğini gösterir. Dinamik kelepçe deneyleri ve modellemeyi birleştirerek, sıradan voltaj kaydı ve akım kelepçe teknikleri ile modelleri mümkün olandan daha doğrudan test etmek mümkündür. Dinamik kelepçe deneylerinden elde edilen sonuçlar (Şekil 5) HN modelini daha da iyileştirmek için kullanılacaktır. Burada gösterilen temel dinamik sıkıştırma yöntemi, voltaj kelepçe deneyleri ile matematiksel bir nöron akım modeli belirlenebiliyorsa, incelenen herhangi bir nöronun özelliklerini yansıtacak şekilde özelleştirilebilir.
Burada gösterilen tipteki deneylerin başarıyla tamamlanması, keskin bir mikroelekrod kullanırken bir HN veya diğer nöronun dikkatli bir şekilde delinmesini gerektirir, çünkü güçlü patlama elektrot penetrasyonu ile kısıtlanır1. (Tanıtılan sızıntıyı en aza indiren tüm hücreli yama kayıt teknikleri diğer nöronlar için de geçerlidir, ancak sülük nöronlarında iyi çalışmaz.) HN nöronunun saplanmanın nörona en az zarar vermesi (ilave sızıntı) ve giriş direncinin izlenmesi ve başarılı deneyler için 60-100 MOhm aralığında olması önemlidir4.
Dinamik kelepçe güçlü bir tekniktir, ancak nöronal geometri tarafından dayatılan sınırlamalara sahiptir, çünkü yapay iletkenlikler kayıt elektrodunun yerinde uygulanır- genellikle hücre gövdesi- ritim üreten akımların genellikle lokalize olduğu yerde değil5,6,10. Sülük HN nöronlarında, hücre gövdesi, çoğu aktif akımın lokalize olduğu nöronun entegrasyon bölgesine (ana neurit) elektriksel olarak yakındır ve sivri uçlar başlatılır.
The authors have nothing to disclose.
Christian Erxleben’e HN(7) nöronları üzerinde patlama yeteneklerini gösteren ön dinamik kelepçe deneyleri için teşekkür ederiz. Angela Wenning deneylere uzman tavsiyesiyle yardım etti. Nih’i, GSC ve RLC’ye Grant 1 R21 NS11355 aracılığıyla bu çalışmayı finanse etmek için kabul ediyoruz.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |