यहां प्रस्तुत गतिशील क्लैंप का उपयोग कर जोंक हार्ट इंटरन्यूरॉन्स में ना+ ++ पंप और लगातार ना+ वर्तमान की भूमिकाओं की जांच के लिए एक विधि है ।
ना+ /K+ पंप, अक्सर न्यूरोनल गतिविधि में एक पृष्ठभूमि समारोह के रूप में के बारे में सोचा, एक जावक वर्तमान(मैंपंप)है कि ना + की आंतरिक एकाग्रता का जवाब देता है योगदानदेता है+ ([Na+]मैं) । फटन न्यूरॉन्स में, जैसे कि केंद्रीय पैटर्न जनरेटर (सीपीजी) न्यूरोनल नेटवर्क में पाया जाता है जो लयबद्ध आंदोलनों का उत्पादन करते हैं, [ना+]मैं और इसलिए आईपंप, पूरे फट चक्र में भिन्न होने की उम्मीद की जा सकती है। विद्युत गतिविधि के लिए यह जवाबदेही, झिल्ली क्षमता से स्वतंत्रता के साथ संयुक्त, मैं गतिशील गुणों के साथ पंप करता हूं जो चैनल-आधारित धाराओं (जैसे, वोल्टेज या ट्रांसमीटर-गेटेड या लीक चैनल) के लिए आम नहीं है। इसके अलावा, कई न्यूरॉन्स में, पंप की गतिविधि को विभिन्न प्रकार के मॉड्यूलर द्वारा संग्राहक किया जाता है, जिससे लयबद्ध फोड़ गतिविधि में मैंपंप की संभावित भूमिका का विस्तार करता है। इस कागज से पता चलता है कि कैसे मॉडलिंग और गतिशील क्लैंप तरीकों का एक संयोजन का उपयोग करने के लिए निर्धारित कैसे मैंपंप और लगातार ना के साथ अपनी बातचीत+ वर्तमान प्रभाव एक CPG में लयबद्ध गतिविधि । विशेष रूप से, यह पेपर औषधीय लीच के हृदय इंटरन्यूरॉन्स में एक गतिशील क्लैंप प्रोटोकॉल और कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग विधियों पर ध्यान केंद्रित करेगा।
लीच में दिल की धड़कन एक सीपीजी द्वारा संचालित होती है जिसमें 9 द्विपक्षीय जोड़े हार्ट इंटरन्यूरॉन्स (एचएन) होते हैं जो कई मध्य-शरीर के सेगमेंटल गैंगलिया में वितरित होते हैं। सीपीजी के मूल में3 और 4खंडीय गंगलिया में स्थित इंटरन्यूरॉन्स के पारस्परिक रूप से निरोधात्मक जोड़े हैं जो आधे केंद्र के ऑसिलिटर्स (एचसीओ)(चित्रा 1 ए)बनाते हैं। ये न्यूरॉन्स तब फटते रहते हैं जब बायोक्यूललाइन1का उपयोग करके औषधीय रूप से अलग – थलग कर दिया जाता है। अन्य, जैसे कि 7खंडीय गैंगलिया (इस प्रोटोकॉल का ध्यान) में जोड़ी, भी फटने वाले हैं, जो संश्लेषण रूप से अलग-थलग होने पर फटने वाली गतिविधि का उत्पादन करने में सक्षम हैं। वे पारस्परिक रूप से जुड़े नहीं हैं और केवल उतरते इनपुट प्राप्त करते हैं, और इस प्रकार आसानी से तंत्रिका कॉर्ड के बाकी हिस्सों से गैंगलियन को तोड़कर अलग हो जाते हैं। यह स्वतंत्र फोड़ गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए तेज माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के साथ प्रवेश के कारण शुरू की गई रिसाव धारा के प्रति संवेदनशील है, लेकिन ढीले पैच विधियों के साथ रिकॉर्ड होने पर सख्ती से फट जाती है1।
दोनों व्यक्तिगत एचएन न्यूरॉन्स और एचएन एचसीओ मॉडलिंग किया गया है (हॉगकिन-हक्सले आधारित एचएन न्यूरॉन्स के एकल आइसोपॉपेंशियल डिब्बे मॉडल सभी प्रायोगिक रूप से पहचाने गए वोल्टेज-गेटेड और सिनैप्टिक धाराओं से युक्त), और जीवित प्रणाली की सभी फट विशेषताओं को सफलतापूर्वक2पर कब्जा कर लिया गया है। मायोमोडुलिन, लीच में एक अंतर्जात न्यूरोपेप्टाइड, अलग एचएन न्यूरॉन्स और एचएन एचसीओ की फट लय की अवधि (टी) को स्पष्ट रूप से कम कर देता है। यह मॉड्यूलर एच-करंट (हाइपरपोलराइजेशन-एक्टिवेटेड आवक वर्तमान, आईएच)को बढ़ाने और आईपंप3को कम करने के लिए कार्य करता है। इस अवलोकन ने इस बात की खोज की कि मैं आई एच के साथ कैसे इंटरैक्ट करता हूं,और कैसे उनके सह-मॉड्यूलेशन एचएन न्यूरॉन्स की लयबद्ध गतिविधि में योगदान देते हैं। पंप की सक्रियता में वृद्धि [ना+]मैं (आयनोफोर मोनेंसिन का उपयोग करके) एचएन एचसीओ और अलग एचएन न्यूरॉन्स4दोनों में एचएन फट लय को गति देता है। यह स्पीड-अप आई एच पर निर्भर था। जब मुझे अवरुद्ध किया गया था (2 mM Cs+),पंप सक्रियण की इस विधि से फट अवधि को बदला नहीं गया था; हालांकि, फट अवधि (बीडी) में कटौती की गई थी, और एचएन एचसीओ और अलग एचएन न्यूरॉन्स4दोनों में इंटरबर्स्ट इंटरवल (आईबीआई) बढ़ गया।
इस प्रोटोकॉल के लिए, पंप वर्तमान, आईपंपसहित एक जीवित एचएन (7) न्यूरॉन की सभी धाराओं को एचएन मॉडल में इस प्रकार शामिल किया गया है:
(1)
जहां सी झिल्ली क्षमता (एनएफ में) है, वी झिल्ली क्षमता (वीमें), टी समय है (एस में)। विस्तृत आयनिक वर्तमान विवरण और समीकरणों को कहीं और वर्णित किया गया है2,4. पूरा एचएन मॉडल न्यूरॉन वास्तविक समय(चित्रा 2)में चलाता है । सॉफ्टवेयर को प्रकाशन पर गिटहब पर उपलब्ध कराया जाएगा और यह सामग्री तालिकामें वर्णित डिजिटल सिग्नल प्रोसेसिंग बोर्ड पर चलाने के लिए उपयुक्त होगा। यहां, पूछताछ का ध्यान ना+ +/ K+ पंप वर्तमान(मैंपंप)और वोल्टेज-gated महत्वपूर्ण ना+ प्रवाह योगदान धाराओं: एक तेजी से ना+ वर्तमान(मैंना)और एक लगातार ना+ वर्तमान(मैंपी)है । इन धाराओं के अधिकतम आचरण
क्रमशः हैं। ना+/ K+ पंप दो एक्स्ट्रासेलुलर के + आयनों के लिए तीन इंट्रासेलुलर ना+ आयनों का आदान-प्रदान करता है, इस प्रकार एक शुद्ध जावक वर्तमान का उत्पादन होता है। महत्वपूर्ण बात, यह न्यूरॉन से 3 गुना अधिक एनए+ पंप करता है क्योंकि यह वर्तमान इंगित करता है, जो इंट्रासेलुलर ना+ एकाग्रता की गणना के लिए महत्वपूर्ण है।
ना+ /K+ पंप वर्तमान इंट्रासेल्युलर ना+ सांद्रता पर निर्भर करता है और निम्नलिखित सिग्माइडल फ़ंक्शन द्वारा व्यक्त किया जाता है:
(2)
जहां [ना]मैं इंट्रासेलुलर ना+ एकाग्रता है, अधिकतम ना +/K+ पंप वर्तमान है, [ना]ih ना+ /K+ पंप की आधी सक्रियता के लिए इंट्रासेल्युलर ना+ एकाग्रता है, और [ना] ना + की संवेदनशीलता है+ / [ना]मैं ना+ आईपी और आई ना द्वारा किए गए प्रवाह के परिणामस्वरूप बनाता हूं और ना+ + / मैंएच और मैंकुल Na+ प्रवाह कोलीक का योगदान छोटा है और वास्तविक समय मॉडल में नहीं माना जाता है ।
(3)
जहां, वी इंट्रासेलुलर ना+ जलाशय की मात्रा (~ 6.7 पीएल) है, एफ फैराडे का स्थिर है, और बाहाक्षेपक ना+ एकाग्रता को स्थिर रखा जाता है।
वोल्टेज-गेटेड और रिसाव चालनों को अलग किया गया है – ये झिल्ली क्षमता का जवाब देते हैं – पंप वर्तमान से, जिसे गणना किए गए इंट्रासेल्युलर ना+ एकाग्रता ([ना+]i) द्वारा विनियमित कियाजाता है। [ना+] मैं तेजी से ना+ वर्तमान(मैंना) के माध्यम से ना+ प्रवेश के माध्यम से बनाया गया है जो एक्शन क्षमता (स्पाइक्स) और लगातार ना+ वर्तमान(आईपी)का उत्पादन करता है जो स्पाइकिंग का समर्थन करने के लिए depolarization प्रदान करता है। [ना+] मैं, बदले में, ना+के निष्कासन के माध्यम से पंप की कार्रवाई से कम है . बेसलाइन रहने वाले एचएन मूल्यों (5nS) और
(150 एनएस) ग्रहण किया गया है, और हम किसी भी जोड़ा गतिशील क्लैंप का हिसाब
लेते हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह पता लगाने के लिए कि यह एक एचएन में लयबद्ध फटने को नियंत्रित करने के लिए वोल्टेज-गेटेड धाराओं (वर्तमान प्रोटोकॉल में लगातार ना+ वर्तमान) के साथ कैसे बातचीत करता है, यह पता लगाने के लिए वास्तविक समय में ठीक और रिवर्सली पंप में हेरफेर करना है। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, गतिशील क्लैंप का उपयोग किया गया था, जो कृत्रिम रूप से कमांड पर पेश करता है, किसी भी वर्तमान की एक सटीक मात्रा जिसकी गणना मॉडल के रूप में की जा सकती है। इस विधि पंप है, जो पूरे ऊतक को प्रभावित करता है के औषधीय हेरफेर पर लाभ है, बंद लक्ष्य प्रभाव है कि अक्सर रिवर्स करने के लिए कठिन हो सकता है, और ठीक हेरफेर नहीं किया जा सकता है । गतिशील क्लैंप5,6 वास्तविक समय(चित्रा 1B)में एक रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन के वोल्टेज को पढ़ता है और वास्तविक समय में, मॉडल समीकरणों और किसी भी या के निर्धारित मूल्यों के आधार पर किसी भी वर्तमान की मात्रा की गणना और इंजेक्ट करता
है। इसी तरह के तरीकों को आसानी से किसी भी न्यूरॉन पर लागू किया जा सकता है जिसे इंट्रासेल्युलर रूप से दर्ज किया जा सकता है। हालांकि, मापदंडों को चुने गए न्यूरॉन के लिए फिर से जाना होगा, और न्यूरॉन को सिनैप्टिक इनपुट से अलग किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, औषधीय रूप से।
मॉडलिंग, गतिशील क्लैंप, और परिणामस्वरूप विश्लेषण है कि वे सक्षम कैसे व्यक्तिगत और आयनिक चालन के समूहोंकी खोज के लिए उपयोगी तकनीक हैं/ इन तकनीकों के उपयोग से पता चलता है कि कैसे ना+ +/ K+ पंप वर्तमान(मैंपंप)वोल्टेज-gated धाराओं के साथ बातचीत, विशेष रूप से लगातार ना+ वर्तमान(मैंपी),जोंक दिल की धड़कन पैटर्न जनरेटर के कोर एचएन में मजबूत फोड़ को बढ़ावा देने के लिए । गतिशील क्लैंप प्रयोगों और मॉडलिंग के संयोजन से, साधारण वोल्टेज रिकॉर्डिंग और वर्तमान क्लैंप तकनीकों के साथ संभव होने की तुलना में अधिक सीधे मॉडलों का परीक्षण करना संभव है। डायनेमिक क्लैंप प्रयोगों(चित्रा 5)से एकत्र किए गए परिणामों का उपयोग एचएन मॉडल को और अधिक परिष्कृत करने के लिए किया जाएगा। यहां प्रदर्शित गतिशील क्लैंपिंग की मूल विधि को अध्ययन के तहत किसी भी न्यूरॉन के गुणों को प्रतिबिंबित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है यदि न्यूरोनल धाराओं का गणितीय मॉडल वोल्टेज क्लैंप प्रयोगों के साथ निर्धारित किया जा सकता है।
यहां दिखाए गए प्रकार के प्रयोगों के सफल समापन के लिए तेज माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करते समय एचएन या अन्य न्यूरॉन के सावधानीपूर्वक सूली पर काबू पाने की आवश्यकता होती है, क्योंकि विद्युत प्रवेश1द्वारा मजबूत फटने में कटौती की जाती है। (पूरे सेल पैच रिकॉर्डिंग तकनीक है, जो शुरू की रिसाव को कम करने, अन्य न्यूरॉन्स के लिए भी लागू होते हैं, लेकिन जोंक न्यूरॉन्स पर अच्छी तरह से काम नहीं करते.) यह महत्वपूर्ण है कि एचएन न्यूरॉन की सूली न्यूरॉन (जोड़ा रिसाव) को कम से कम नुकसान पहुंचाती है, और इनपुट प्रतिरोध की निगरानी की जानी चाहिए और सफल प्रयोगों के लिए 60-100 MOhms की सीमा में होना चाहिए4.
गतिशील क्लैंप एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन इसकी सीमाएं न्यूरोनल ज्यामिति द्वारा लगाई जाती हैं क्योंकि कृत्रिम आचरण रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की साइट पर लागू किए जाते हैं – आमतौर पर सेल बॉडी- उस साइट पर नहीं जहां ताल पैदा करने वाली धाराएं आमतौर पर स्थानीयकृत होती हैं5,6,10। जोंक एचएन न्यूरॉन्स में, सेल शरीर न्यूरॉन के एकीकरण क्षेत्र (मुख्य न्यूराइट) के करीब है जहां सबसे सक्रिय धाराओं को स्थानीयकृत किया जाता है, और स्पाइक्स शुरू किए जाते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम एचएन (7) न्यूरॉन्स पर प्रारंभिक गतिशील क्लैंप प्रयोगों के लिए क्रिश्चियन एर्क्सलेबेन को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने उनकी फटने की क्षमताओं का प्रदर्शन किया। एंजेला वेनिंग ने विशेषज्ञ सलाह के साथ प्रयोगों की सहायता की । हम अनुदान 1 R21 NS111355 के माध्यम से जीएससी और आरएलसी के लिए इस काम के वित्तपोषण के लिए NIH स्वीकार करते हैं ।
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |