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Biochemistry

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Abstract

La trascrizione genica è un processo essenziale nella biologia cellulare e consente alle cellule di interpretare e rispondere a segnali interni ed esterni. I metodi tradizionali di popolazione di massa (Northern blot, PCR e RNAseq) che misurano i livelli di mRNA non hanno la capacità di fornire informazioni sulla variazione da cellula a cellula nelle risposte. La visualizzazione e la quantificazione precisa di singole cellule e alleliche è possibile tramite ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH). RNA-FISH viene eseguito ibridando RNA bersaglio con sonde oligonucleotidiche marcate. Questi possono essere ripresi in modalità di throughput medio/alto e, attraverso pipeline di analisi delle immagini, forniscono dati quantitativi su RNA sia maturi che nascenti, il tutto a livello di singola cellula. Le fasi di fissazione, permeabilizzazione, ibridazione e imaging sono state ottimizzate in laboratorio per molti anni utilizzando il sistema modello qui descritto, che si traduce in un'analisi a cella singola di successo e robusta dell'etichettatura smFISH. L'obiettivo principale con la preparazione e l'elaborazione dei campioni è quello di produrre immagini di alta qualità caratterizzate da un elevato rapporto segnale-rumore per ridurre i falsi positivi e fornire dati più accurati. Qui presentiamo un protocollo che descrive la pipeline dalla preparazione del campione all'analisi dei dati in combinazione con suggerimenti e passaggi di ottimizzazione da adattare a campioni specifici.

Introduction

La trascrizione e la traduzione genica sono i due principali processi coinvolti nel dogma centrale della biologia, che vanno dalla sequenza del DNA all'RNA alla proteina1. In questo studio, ci concentriamo sulla produzione di RNA messaggero (mRNA) durante la trascrizione. La nascente molecola di RNA comprende sia introni non codificanti che esoni codificanti. Gli introni vengono splicati co-trascrizionalmente prima che l'mRNA si muova nel citoplasma per la traduzione sui ribosomi2,3.

Tradizionalmente, la misurazione dell'mRNA viene eseguita in popolazioni di massa di cellule (da centinaia a milioni) con saggi classici come RT-qPCR o Northern blotting. Sebbene molto potenti, questi metodi sono limitati in quanto non forniscono informazioni sulla variazione da cellula a cellula (eterogeneità fenotipica), sull'identificazione del numero di alleli trascrizionalmente attivi e, forse ancora più importante, mancano di informazioni spaziali. Più recentemente, le tecnologie a livello di genoma che consentono il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (RNAseq) hanno iniziato a colmare il divario tra i metodi di imaging e il sequenziamento4. Tuttavia, RNAseq soffre di efficienze di rilevamento relativamente basse e le fasi di elaborazione comportano la completa perdita di informazioni spaziali5. Sebbene l'RNAseq a singola cellula possa fornire informazioni sull'eterogeneità fenotipica tra una popolazione di cellule isogeniche, l'ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA (RNA-FISH) può facilitare un'esplorazione più completa dell'espressione genica bersaglio a livello spaziale e su base allele-per-allele6,7.

RNA FISH è una tecnica che consente il rilevamento e la localizzazione di molecole di RNA bersaglio in cellule fisse. A differenza dei metodi precedenti e laboriosi, l'attuale RNA-FISH all'avanguardia utilizza sonde di acidi nucleici disponibili in commercio che sono complementari alle sequenze di RNA bersaglio e queste sonde si ibridano ai loro bersagli mediante l'accoppiamento di basi Watson-Crick8. Le prime tecniche di ibridazione in situ hanno coinvolto un protocollo simile stabilito da Gall e Pardue nel 1969, poiché un campione è stato elaborato con sonde di acido nucleico che si sono specificamente ibridate a un RNAbersaglio 9. Originariamente il test è stato eseguito utilizzando la rilevazione radioattiva o colorimetrica; tuttavia, nel 1980, lo sviluppo di protocolli di ibridazione fluorescente in situ (FISH) a DNA FISH e successivamente RNA FISH ha aperto la strada verso il rilevamento più sensibile e il potenziale per il multiplexing10,11.

Ulteriori sviluppi nell'RNA FISH hanno portato alla capacità di rilevare e quantificare singole molecole di RNA (smFISH)12,13. Il rilevamento diretto è un metodo in cui le sonde stesse sono etichettate con fluorofori. Una sfida con smFISH è che c'è bisogno di abbastanza sonde / bersaglio ibridanti per facilitare il rilevamento di segnali fluorescenti come punti distinti e limitati dalla diffrazione. Per affrontare questo problema, si può usare un set di sonde di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento brevi complementari a varie regioni dell'RNA bersaglio8,12,14. Il legame di più sonde aumenta la densità del fluoroforo locale, rendendo l'RNA visibile come un punto distinto ad alta intensità mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo è vantaggioso perché il legame off-target degli oligonucleotidi nel pool del set di sonde può essere distinto dal vero segnale spot dell'RNA analizzando quantitativamente la dimensione e l'intensità dello spot per distinguere tra segnale reale e legame oligonucleotidico spurio, facilitando così un'analisi più accurata riducendo i falsi positivi12.

Metodi alternativi per rilevare l'mRNA sono il classico metodo di traduzione nick basato su clone BAC e il sistema di DNA ramificato di più recente sviluppo. Nel metodo di traduzione nick clonato con BAC, il DNA da etichettare viene inciso enzimaticamente e un nuovo nucleotide viene aggiunto all'estremità esposta di 3'. L'attività della DNA polimerasi I aggiunge un nucleotide etichettato risultando nella sonda desiderata15,16. La tecnica del DNA ramificato coinvolge sonde oligonucleotidiche che si ibridano in coppie a bersagli di RNA e queste sonde sono amplificate utilizzando più molecole di amplificazione del segnale. Questo metodo può migliorare significativamente il rapporto segnale-rumore, ma l'amplificazione può distorcere la quantificazione accurata poiché i punti fluorescenti possono essere molto diversi per dimensioni e intensità17.

Come sistema modello per questo protocollo, che è pienamente impiegato come parte della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program per quantificare gli effetti delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino a Galveston Bay / Houston Ship Channel, abbiamo utilizzato la linea cellulare positiva al cancro al seno del recettore degli estrogeni (ER) MCF-7 trattata durante la notte con un agonista ER, 17β-estradiolo (E2)7,18,19. E2 regola molti geni bersaglio ER, tra cui il prototipo del gene bersaglio ER, GREB17,20,21,22. Il protocollo smFISH qui descritto utilizza un set di due set di sonde separati spettralmente mirati a GREB1; uno che si ibrida agli esoni e l'altro agli introni, consentendo la misurazione dell'RNA7sia maturo che nascente. Usiamo quindi la microscopia a epifluorescenza accoppiata con la deconvoluzione per l'immagine di campioni etichettati smFISH e quindi applichiamo routine di analisi delle immagini per quantificare il numero di alleli attivi e RNA maturi per cellula.

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Protocol

Per garantire risultati ottimali, la parte di laboratorio umida di questo protocollo richiede precauzioni standard prive di RNasi in tutte le fasi. Ad esempio, l'uso di punte di pipette filtrate, recipienti sterili e tamponi privi di RNasi è altamente incoraggiato. Si suggerisce anche l'uso di inibitori della RNasi come i complessi di vanadil ribonucleosidi, specialmente per gli RNA bersaglio a bassa abbondanza.

1. Coltura cellulare e configurazione sperimentale

  1. Mantenere le cellule aderenti del cancro al seno MCF-7 (ATCC #HTB-22) in un pallone di coltura tissutale T75 con fenolo-rosso libero (richiesto solo per esperimenti di stimolazione ormonale) Il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-glutammina, 1 nM piruvato di sodio, 50 U.I./mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina.
  2. Posizionare i coperchi rotondi rivestiti di poli-D-lisina incisi con acido (da 0,16 a 0,19 mm di spessore, 12 mm di diametro) in una piastra di coltura tissutale multiwell 24.
    NOTA: Utilizzare 1 M HCl per acidare i coverslip e rivestire con una soluzione da 1 mg/mL di poli-D-lisina ricostituita in PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca++ e Mg++)secondo protocolli standard.
  3. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e lavare una volta con 5 ml di PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca++ e Mg++). Staccare le celle MCF-7 utilizzando 2-3 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,25%. Una volta staccate le cellule, neutralizzare la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% con un volume uguale di mezzi di crescita.
  4. Trasferire le celle nella sospensione del supporto in un tubo conico da 15 ml, ruotare verso il basso a 391 x g per 1 minuto per pellettare le celle. Rimuovere con attenzione il mezzo dal tubo conico senza disturbare il pellet cellulare e risospenare le cellule in una quantità appropriata di mezzi di trattamento.
    NOTA: Il mezzo di trattamento è DMEM privo di fenolo-rosso integrato con 5% di FBS distinato e dializzato al carbone, 2 mM di L-glutammina, 1 nM piruvato di sodio, 50 U.I./mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina. Questo mezzo è essenziale per gli esperimenti di stimolazione dell'ormone steroideo in quanto la componente sierica è in gran parte impoverita di steroidi dal carbone che spoglia i mezzi e ha ridotto i fattori di crescita tramite dialisi.
  5. Semina le cellule su coperture nella piastra multiwell 24 a 60.000-70.000 cellule per pozzo in 500 μL di mezzo di trattamento. Per questo esperimento, la confluenza cellulare dovrebbe essere di circa il 70-80% all'inizio del trattamento. Ottimizza la densità di semina delle cellule in base al tipo di cellula, al tasso di crescita e alla lunghezza dell'esperimento per evitare la confluenza, che complica l'analisi delle immagini.
    NOTA: per una migliore analisi delle immagini e delle immagini, evitare l'aggregazione delle cellule. A tale scopo, mescolare accuratamente l'aliquota delle cellule pipettando (o brevemente vortice) le cellule un paio di volte prima di erogarle nei pozze. Prima di rimettere le cellule placcate nell'incubatrice, lasciare che le cellule si depositino nella cappa di coltura dei tessuti per circa 20 minuti aiuta a ridurre l'aggregazione cellulare.
  6. Incubare le cellule per almeno due giorni prima dei trattamenti per garantire la sincronizzazione del ciclo cellulare e la riduzione del background a causa di eventuali molecole di segnalazione che rimangono nel siero spogliato / dializzato dei mezzi di crescita.
  7. Dopo un'incubazione di 48 ore nei mezzi di trattamento, trattare le cellule MCF-7 con 10 nM 17β-estradiolo (E2) e controllo del veicolo (DMSO), diluite nei mezzi di trattamento per 24 ore. Questo trattamento utilizza una dose saturante di E2 per indurre una risposta massima. Eseguire esperimenti di durata temporale e dose-risposta per determinare empiricamente le condizioni per diversi geni bersaglio, modelli cellulari e tipo di trattamenti. Ad esempio, vedi la nostra recente pubblicazione7.

2. Preparazione dei buffer

  1. Per preparare il tampone di fissazione, diluire la formaldeide monomerica purificata (venduta dai fornitori di microscopia elettronica come paraformaldeide al 16%) al 4% in PBS sterile Ca++/ Mg++ (soluzione salina tamponata con fosfato più Ca++ e Mg++). Aggiungere vanadyl ribonucleoside complexes (VRC) al tampone di fissazione per una concentrazione finale di 2 mM per ritardare la degradazione dell'RNA.
    1. Calcolare la quantità totale di tampone di fissazione in base alla richiesta di 300-500 μL di fissativo per pozzettilo di una piastra multiwell 24. Conservare la formaldeide al 4% su ghiaccio fino a quando non è necessario nella fase di fissazione.
      NOTA: rendere nuovo il buffer di fissazione per ogni esperimento.
      ATTENZIONE: La formaldeide è un teratogeno che viene assorbito attraverso la pelle. Utilizzare questa sostanza chimica in una cappa aspirante insieme a DPI appropriati in base alle normative istituzionali.
  2. Per la fase di permeabilizzazione, preparare il 70% di etanolo in acqua priva di nucleasi. Un'opzione alternativa è 0,5% Triton-X100 in PBS sterile Ca++/ Mg++ più 2 mM di VRC. Calcolare la quantità totale di tampone di permeabilizzazione necessaria utilizzando 500 μL di tampone per pozzo.
  3. Per preparare 9 mL del tampone di ibridazione, aggiungere 2 mL di solfato di destrano al 50% e 1 mL di tampone SSC (citrato di sodio salino) a 6 mL di acqua priva di nucleasi. Vortice per mescolare accuratamente il buffer di ibridazione. Questo buffer può essere conservato a 4 °C per un massimo di una settimana.
  4. Ci sono cinque fasi di lavaggio separate che richiedono 2x tampone salino di citrato di sodio (SSC). Calcolare il volume finale di 2x buffer SSC necessari anticipando 500 μL di buffer per coverslip per fase di lavaggio. Diluire la quantità richiesta di buffer SSC 20x stock in acqua priva di nucleasi. 2 mM VRC possono essere aggiunti ai passaggi di lavaggio come ulteriore precauzione. Questo buffer può essere conservato a temperatura ambiente per tutta la durata delle fasi di lavorazione.

3. Fissazione per RNA FISH

  1. Dopo il trattamento, rimuovere il supporto dai fori e lavare una volta con PBS Ca++/Mg++sterile e freddo . Se viene utilizzato un modello di cella a bassa aderenza, non utilizzare un vuoto per aspirare il liquido; utilizzare il pipettaggio manuale per rimuovere con cura i supporti dal lato del pozzo e omettere la fase iniziale di lavaggio. Aggiungere il tampone di fissaggio da 500 μL per 30 minuti sul ghiaccio.
    NOTA: se il campione è soggetto a degradazione dell'RNA, utilizzare PBS sterile con 2 mM VRC per la fase di lavaggio a questo punto.
  2. Rimuovere il fissativo e smaltirlo nei rifiuti chimici secondo le normative istituzionali. Lavare le cellule due volte con PBS sterile freddo Ca++/ Mg++ per 3 minuti.
  3. Rimuovere PBS e aggiungere 500 μL di etanolo al 70% in ciascun pozzo. Sigillare la piastra a 24 pozzetti con un film plastico di paraffina. Posizionare su un rotatore a 4 °C per un minimo di quattro ore. È meglio lasciare i campioni al 70% di etanolo durante la notte. Il protocollo può essere messo in pausa a questo punto e i campioni possono essere conservati per un massimo di una settimana in etanolo al 70%.
    NOTA: un Triton-X100 allo 0,5% in PBS con soluzione VRC da 2 mM può essere utilizzato come alternativa. Incubare i campioni in 500 μL di questo tampone di permeabilizzazione per 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore. Se si utilizza questo buffer di permeabilizzazione, il protocollo non può essere messo in pausa a questo punto e deve continuare attraverso la fase di ibridazione.

4. Ibridazione per RNA FISH

  1. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e lavare una volta in 500 μL di 2x tampone SSC più il 10% di formammide per 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore.
  2. Preparare il buffer di ibridazione completo. Calcolare circa 30 μL di buffer di ibridazione completa per coverslip. Aggiungere formammide al buffer di ibridazione per raggiungere la percentuale necessaria. Ad esempio, se sono necessari 500 μL di tampone di ibridazione completa, allora consisterebbe in 450 μL del tampone di ibridazione precedentemente realizzato più 50 μL di formammide di grado molecolare per raggiungere il 10% vol / vol. Vortice brevemente da mescolare.
    ATTENZIONE: La formamide è un teratogeno che viene assorbito attraverso la pelle. Utilizzare questa sostanza chimica in una cappa aspirante insieme a DPI appropriati secondo le normative istituzionali.
  3. Diluire le sonde GREB1 intron (etichettato con Atto 647N) e GREB1 esone (etichettato con Quasar 570) 1:300 nel buffer di ibridazione. Mescolare tramite pipettaggio. Proteggere questo buffer dalla luce e utilizzarlo immediatamente.
    NOTA: Le sonde sono state progettate e prodotte come dettagliato in Stossi et al7. Le sonde sono solitamente fornite come un pool di sonde oligonucleotidiche essiccate che devono essere ricostituite in tampone TE privo di RNAsi secondo il protocollo del produttore14. La soluzione stock per queste sonde era quindi di 12,5 μM; la concentrazione di lavoro delle sonde è di 42 nM.
  4. Preparare una camera di umidificazione per la fase di ibridazione notturna. Posare un pezzo di pellicola di plastica di paraffina, non esposta verso l'alto, in una capsula di Vetro di Petri pulita con un decontaminante superficiale per rimuovere le RSI. Saturare due asciugamani di carta con acqua sterile e posizionarli lungo i bordi della capsula di Petri per fornire umidità, poiché l'essiccazione può distruggere l'etichettatura specifica.
  5. Aliquota delle sonde punteggiando 30 μL di sonde in tampone di ibridazione sul lato pulito del film plastico di paraffina. Distribuire le aliquote delle sonde in modo che le coperture non entrino in contatto tra loro.
  6. Utilizzando una pinzede sterilizzata, capovolgere delicatamente la cella di coverslips verso il basso sulle sonde nella capsula di Petri di vetro. Evitare bolle d'aria e non applicare pressione sui coperchi.
    NOTA: non scartare la piastra di coltura tissutale con il buffer SSC 2x, poiché sarà necessario per i passaggi successivi.
  7. Sigillare la capsula di Vetro di Petri con pellicola di plastica di paraffina e coprire la lastra con un foglio per evitare l'esposizione alla luce ai fluorofori. Incubare durante la notte, fino a 16 ore, a 37 °C su una superficie piana non rotante. Il tempo di incubazione può essere variato empiricamente, tuttavia si raccomanda un minimo di 4 ore.
    NOTA: i coverslip sono suscettibili di scivolare durante l'incubazione nel buffer di ibridazione, il che può portare a macchie secche sul coverslip e danneggiare il campione.

5. Preparazione dei campioni per l'imaging

  1. Il giorno successivo, rimuovere i coperchi dalla camera umidificante usando una pinica e riportarli alla piastra a 24 pozzetti con il lato cellulare verso l'alto. Aggiungere 500 μL di tampone SSC 2x fresco più il 10% di formammide per eliminare la sonda in eccesso e l'ibridazione non specifica.
    NOTA: Proteggere i campioni dalla luce da questo punto in poi.
  2. Lavare le celle due volte con 500 μL di 2x tampone SSC più il 10% di formammide per 15 minuti ciascuna a 37°C su un rotatore riscaldato.
  3. Controbattere il DNA con DAPI a 1 μg/mL in 2x tampone SSC per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore.
  4. Lavare una volta con 2x tampone SSC per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Montare i coperchi su vetrini utilizzando supporti di montaggio non indurenti dopo aver rimosso qualsiasi tampone SSC 2x in eccesso con un tovagliolo di carta e un lavaggio rapido in acqua priva di nucleasi per eliminare i sali in eccesso. Infine, sigillare le coperture con uno smalto trasparente.

6. Microscopia ad alta risoluzione ed elaborazione delle immagini

  1. Immagina i campioni su un microscopio a epifluorescenza ad ampio campo utilizzando un obiettivo a olio 60x o 100x e una fotocamera sCMOS. Vedi la tabella dei materiali per il microscopio specifico e l'obiettivo utilizzato per questo esperimento.
    1. Imaging completo non appena i campioni vengono completamente elaborati per evitare la degradazione del segnale dipendente dal tempo.
      NOTA: In questo esperimento viene utilizzato olio ad immersione con un indice di rifrazione (RI) di 1,516. I test empirici dovrebbero essere eseguiti per abbinare il RI dell'olio a campioni specifici, poiché le discrepanze del RI comporteranno aberrazioni della funzione di diffusione del punto che influenzeranno la deconvoluzione dell'immagine.
  2. Le immagini vengono acquisite con una dimensione dei pixel laterali di 0,10827 μm.
  3. Ottimizzare la quantità di illuminazione dalla sorgente luminosa (cioè la percentuale di trasmittanza) e i tempi di esposizione per ciascun canale (filtri DAPI, TRITC, CY5 in questo particolare esempio) utilizzando il campione che dovrebbe avere la massima intensità (ad esempio, controlli positivi). In questo esperimento, il campione trattato con E2 dovrebbe avere un'intensità maggiore per entrambi i set di sonde GREB1. Generalmente, la trasmittanza percentuale per le sonde greb1 introne ed esone è del 50-100% e i tempi di esposizione vanno da 0,25 a 0,60 secondi.
  4. Inoltre, acquisire immagini in condizioni che evitino il fotosableaching e/o qualsiasi saturazione dei pixel della fotocamera. Nella nostra esperienza, ci dovrebbe essere una differenza minima di circa dieci volte tra lo sfondo e l'intensità del segnale. La saturazione di pochi pixel / campo può verificarsi a causa di segnali non specifici nel campione (ad esempio, sporcizia sul coverslip, aggregati di sonda all'esterno della cella), che possono essere accettabili, ma solo se le regioni sature non sono incluse nella quantificazione.
  5. Per impostare l'acquisizione di uno z-stack, concentrarsi sul campione nel canale DAPI. Selezionare la parte superiore e inferiore dello z-stack alle distanze in cui i nuclei colorati DAPI diventano sfocati. La dimensione del gradino z-stack che abbiamo usato è di 0,25 μm per fetta e lo z-stack totale dovrebbe coprire l'intera cella (circa 10 μm nelle celle MCF-7). Tuttavia, la dimensione del passo z-stack cambierà in base all'obiettivo utilizzato e dovrebbe seguire il criterio di campionamento nyquist.
    NOTA: Gli introni sono solitamente presenti solo nel nucleo; tuttavia, gli esoni sono sia nel nucleo che nel citoplasma. Pertanto, l'impostazione dello z-stack come descritto sopra catturerà la maggior parte dell'etichettatura dell'introne e dell'esone poiché lo z-stack comprende l'intera cella.
  6. In genere, l'immagine di un minimo di 200 celle per l'analisi quantitativa in esperimenti preliminari per catturare un'istantanea dell'entità della risposta e della variazione tra le cellule.
  7. Alcune cellule con immagini sono escluse dall'analisi finale (cioè il tasso di abbandono) perché saranno filtrate dalla pipeline di analisi (cioè cellule che toccano il bordo dell'immagine, cellule apoptotiche / mitotiche).
    NOTA: quando si selezionano le aree dell'immagine, ci sono alcuni fattori da tenere a mente. Scegli aree con celle uniformemente distribuite e non sovrapposte come definito dalla fluorescenza nucleare etichettata DAPI. Inoltre, prova a selezionare le aree che hanno il minor numero di nuclei lungo i bordi dell'area dell'immagine per evitare di contare le celle parziali. L'imaging automatizzato e imparziale è sempre preferito per gli esperimenti che richiedono analisi statistiche.
  8. Dopo l'acquisizione, deconvolvere le immagini utilizzando un algoritmo di restauro aggressivo utilizzando 10 cicli (cioè il numero di iterazioni). Genera proiezioni di massima intensità per l'analisi delle immagini (ometti questo passaggio se è richiesta un'analisi 3D specifica). Salvare tutte le immagini di proiezione in base alla profondità di bit della fotocamera utilizzata; nel nostro caso sono state salvate immagini in scala di grigi TIFF a 16 bit. Le immagini RGB hanno una profondità di bit ridotta con conseguente perdita di informazioni; pertanto, le immagini RGB non sono adatte per l'analisi delle immagini.

7. Analisi delle immagini

  1. Leggi le istruzioni e scarica il notebook jupyter da github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Installare la distribuzione Python anaconda (https://www.anaconda.com/distribution/) versione 3.6 o successiva.
  3. Apri il prompt di anaconda e digita il comando di installazione per installare Simple ITK per anaconda (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Apri il navigatore anaconda e avvia il notebook jupyter. Si aprirà un browser Web che mostra directory e file. Sfoglia le strutture di directory per raggiungere la directory contenente il notebook jupyter scaricato da github.
  5. Aprire il blocco appunti ed eseguire ogni cella premendo contemporaneamente Maiusc e Invio.
  6. Seguire i dettagli di ogni funzione e passaggio forniti nel notebook. Per un diverso set di immagini, potrebbe essere necessario modificare alcuni valori dei parametri.
    NOTA: in breve, i nuclei vengono segmentati dal canale DAPI utilizzando la soglia locale con una dimensione del blocco di 251 pixel, i fori sono stati riempiti e gli oggetti più piccoli di 100 pixel rimossi. I nuclei toccanti sono stati divisi usando un algoritmo spartiacque. La maschera nucleare è stata poi dilatata di 100 pixel e lo spartiacque è stato utilizzato per separare gli oggetti che toccano usando i nuclei come bacini. Per identificare l'RNA allo stato stazionario (esoni), è stata utilizzata la soglia Otsu; per gli alleli attivi trascrizionali (introne), è stata applicata prima una sfocatura gaussiana (sigma = 1) e quindi è stata utilizzata la soglia massima dell'entropia.

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Representative Results

Per analizzare le risposte ormonali tramite smFISH, ad esempio, abbiamo scelto il modello del recettore degli estrogeni (ER) utilizzato nei saggi ad alto rendimento per determinare la presenza di sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino nei disastri ambientali nel contesto della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program7. In questo esperimento, le cellule aderenti del cancro al seno MCF-7 sono state trattate con l'agonista ER 17β-estradiolo (E2, 10 nM) o veicolo (DMSO) per 24 ore. I set di sonde separate spettralmente contro le sequenze introniche GREB1 (Atto 647N, rosso in Figura 1)ed esoniche (Quasar 570, verde in Figura 1) consentono la visualizzazione e la quantificazione simultanee di mRNA nascente e maturo; importante, segnando il numero di alleli trascrizionalmente attivi in ogni cellula che ha dimostrato di far parte del corso del tempo di risposta agli estrogeni7.

Il protocollo completato genera proiezioni di intensità massima (TIFF) a 16 bit per ogni regione di interesse. La segmentazione nucleare viene eseguita utilizzando nuclei colorati DAPI e i confini cellulari sono stimati espandendo la maschera nucleare. I segnali dell'introne e dell'esone GREB1 vengono quindi segmentati e assegnati a ogni singola cellula. La Figura 1 mostra le immagini deconvolute proiettate al massimo e la loro segmentazione per un campione trattato con DMSO ed E2.

Figure 1
Figura 1: immagini campione smFISH e output della segmentazione delle immagini. (A) Le cellule MCF-7, trattate con DMSO (pannello di sinistra) e 17β-estradiolo (E2, pannello di destra) per 24h, sono state ibridate per colpire gli introni GREB1 (Atto 647N, mRNA nascente, rosso) e gli esoni GREB1 (Quasar 570, mRNA maturo, verde). Le immagini vengono acquisite a 60x/1.42NA, deconvolute e proiettate alla massima intensità. (B) Le immagini di (A) vengono elaborate attraverso la pipeline di analisi delle immagini descritta che definisce la maschera nucleare, stima la maschera cellulare, identifica i singoli mRNA maturi e gli alleli trascrizionalmente attivi. I punti di introne ed esone GREB1 vengono quindi assegnati alle singole cellule. Barra di scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Seguendo la pipeline di analisi delle immagini, abbiamo ottenuto il numero di cellule che non stavano toccando i confini dell'immagine sulla base dell'imaging di dieci campi casuali per trattamento, ed è stato determinato che c'erano 150 cellule trattate con DMSO e 149 cellule trattate con E2. Poiché le cellule ANEUPLOIDI MCF-7 hanno quattro copie del gene GREB1 e con sonde introni ed esoni, i segnali sovrapposti determineranno il numero di alleli e cellule che sono impegnati nella trascrizione attiva24. Abbiamo determinato la frazione della popolazione cellulare per ogni trattamento che aveva da zero a quattro alleli GREB1 attivi contando le macchie sovrapposte di introne ed esoni. Come nel nostro studio precedente, definiamo le cellule trascrizionalmente attive come quelle che mostravano due o più alleli GREB1 attivi7. Come si vede nella Figura 2A-2B,le cellule trattate con E2 hanno una frazione di cellule 4 volte maggiore che mostra due o più alleli GREB1 attivi rispetto alle cellule trattate con veicolo7.

Figure 2
Figura 2: Quantificazione del GREB1 indotto da E2 a livello di cellula per cellula e allele per allele. (A) La distribuzione del numero di alleli GREB1 attivi per cellula confrontando le cellule trattate con veicolo (barre blu) ed E2 (barre rosse). (B) Frazione di cellule considerate trascrizionalmente attive, qui definite come cellule con due o più alleli GREB1 attivi7. (C) Distribuzione del numero di mRNA maturi GREB1 per cellula per ciascun trattamento. (D) Numero medio di GREB1 RNA/cellula matura rappresentato come valore medio per la popolazione. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli introni vengono spliced fuori dall'mRNA nascente per produrre mRNA maturo che consiste solo di sequenze di esoni. Pertanto, è anche possibile contare il numero di mRNA maturi per cellula quantificando il numero di macchie verdi. La Figura 2C-2D mostra lo spostamento nella distribuzione dell'mRNA/cellula GREB1 maturo e il cambiamento aggregato della piega (20x) nella popolazione cellulare dopo il trattamento con E2.

In linea con le osservazioni originali nell'arco di 24 ore di trattamento con E2, non tutte le cellule rispondono allo stesso modo (cioè, le risposte sono eterogenee nella popolazione MCF-7)7. Ad esempio, il numero di mRNA GREB1 maturi per cellula mostra una vasta gamma di espressione (~ 15 volte) anche nelle cellule trattate con E2 nelle 24 ore; i metodi di quantificazione dell'RNA di massa non riescono a discernere i livelli ad ampio raggio di trascrizione nelle cellule mediante la media statistica. Ciò sottolinea il potere di smFISH di esplorare risposte eterogenee cellula-cellula e allele-per-allele in una popolazione di cellule isogeniche.

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Discussion

La metodologia smFISH descritta si basa sui protocolli7,12,14precedentemente pubblicati. In questo protocollo, spieghiamo i passaggi critici che sono stati ottimizzati dal wet-lab (tra cui densità di semina, tempo di fissazione, permeabilizzazione e concentrazione della sonda), all'imaging e all'analisi delle immagini, fornendo una pipeline sperimentale completa per i laboratori interessati a eseguire analisi a singola cellula della trascrizione genica.

Per facilitare l'analisi di una singola cella, è importante che le celle siano subconfluenti e non si sovrappongano in modo che i bordi delle celle siano stimati senza la necessità di un limite cellulare. Suggeriamo di completare un test di proliferazione cellulare che si estende su una vasta gamma di densità di semina per tutta la durata dell'esperimento per ottimizzare la densità cellulare.

Determinare il tempo di fissazione ottimale è fondamentale per un esperimento smFISH di successo. Abbiamo scoperto che fissare i campioni con formaldeide purificata al 4%, diluita in PBS sterile contenente VRC per 30 minuti su ghiaccio, migliora significativamente la consistenza di immagini smFISH di alta qualità, soprattutto se è richiesta un'analisi strutturale tramite combinazione di anticorpi contro fattori di interesse. La formaldeide fissa i campioni mediante macromolecole reticolanti e può mantenere meglio le strutture cellulari rispetto ad altri metodi di fissazione come quelli che impiegano solventi organici25. Tuttavia, la regolazione del tempo di fissazione e della temperatura è necessaria per il campione specifico per evitare di sovra- o sotto-fissare il campione26. VRC è utile perché riduce la degradazione dell'RNA ed è utile soprattutto per l'RNA27a bassa abbondanza. Ci sono due opzioni con cui abbiamo avuto successo per la fase di permeabilizzazione. Il primo è un'incubazione di etanolo al 70% a 4 °C e il secondo è un'incubazione Triton-X100 allo 0,5% a temperatura ambiente7,14. È possibile eseguire lo stesso protocollo ad alta produttività utilizzando lastre multiwell con fondo di vetro compatibili con l'imaging (96 e 384 pozzi). Il successo costante nell'esecuzione di smFISH è dipeso dall'uso di lastre multiwell in vetro contenenti VRC fissativo e Triton-X 100 allo 0,5% con VRC per la fase di permeabilizzazione. Sebbene le piastre inferiori in plastica ottica siano un'opzione, la qualità dell'immagine e il successo sono stati notevolmente inferiori.

Per l'analisi a cella singola è necessario un elevato rapporto segnale-rumore per filtrare il segnale di fondo e i falsi positivi e identificare correttamente i punti limitati dalla diffrazione. Il segnale di fondo si aggiunge ai valori di intensità del segnale di interesse. Lo sfondo alto deriva spesso da un design sperimentale non ottimale e, sebbene sia sottratto dalle misurazioni dell'intensità fluorescente, è meglio inizialmente immaginare le regioni di interesse con il minor segnale di sfondo possibile28. È necessaria un'elevata gamma dinamica, con una differenza minima di ~ 10 volte, per determinare con successo se il segnale è considerato di fondo o segnale di interesse29. I punti falsi positivi si riferiscono al segnale che risiede al di fuori dei confini cellulari, spesso a causa di coperture scarsamente pulite, lavaggio insufficiente dopo l'ibridazione o aggregazione della sonda che si verifica quando le sonde si auto-associano30. Se si verificano segnali non specifici dovuti al legame spurio dell'oligo set a RNA diversi dal bersaglio (cioè a causa di pseudogeni o somiglianze di sequenza), questi possono essere valutati testando i set di sonde in un modello che non esprime il gene di interesse (ad esempio, MEF knock-out, CRISPR / Cas9 knock-out)31. Inoltre, come con qualsiasi esperimento di microscopia a fluorescenza, le sonde introne ed esone devono essere separate spettralmente. Nel nostro esperimento di esempio, abbiamo scelto i coloranti Atto 647N e Quasar 570 per il set di sonde GREB1 perché sono compatibili con le specifiche dei set di filtri sul microscopio utilizzato, resistenti al fotosciviazione e hanno una resa quantistica relativamente elevata8,14,32. A seconda del campione, si consiglia di realizzare una serie di diluizione della sonda stock (di solito una diluizione da 1:200 a 1:1000 o da 12,5 nM a 62,5 nM) per identificare il miglior rapporto segnale-rumore per ogni set di sonde specifico. Alcuni fornitori forniscono sonde con etichetta personalizzata con fluorofori selezionati dall'utente per aumentare la luminosità, ridurre il fotosbianchezzamento e, se necessario, aggiungere ulteriori 1-2 canali generalmente disponibili sulla maggior parte dei moderni microscopi fluorescenti7,8,14. Sebbene smFISH abbia la capacità di misurare l'RNA a bassa abbondanza, un problema chiave è aumentare la sua sensibilità e capacità di rilevare l'RNA parzialmente degradato, specialmente per i campioni di tessuto. Ottenere un rapporto segnale-rumore più elevato è possibile utilizzando sonde di DNA ramificate progettate per amplificare il segnale, anche se non abbiamo trovato questo approccio utile nei nostri studi33. I microscopi confocali utilizzano una sorgente luminosa focalizzata per illuminare il campione impedendo alla luce fuori fuoco di raggiungere i rilevatori con uno o più fori stenopeici. La microscopia confocale a scansione puntuale è generalmente scoraggiata per l'imaging RNA-FISH perché le sonde si fotospaccano più velocemente dall'illuminazione laser. Tuttavia, a seconda del campione e dell'intensità del segnale, i microscopi confocali possono generare immagini con poca o nessuna perdita di segnale8. Qui, abbiamo utilizzato un microscopio a epifluorescenza ad ampio campo con un obiettivo ad alto ingrandimento e alta apertura numerica per raccogliere il numero massimo di fotoni emessi dalle sonde FISH34. Sebbene le immagini possano essere sfocate da luce sfocata dai piani adiacenti dello z-stack, gli algoritmi di deconvoluzione riparativa vengono applicati alla luce diffratta computazionalmente "riassegnata" tra gli z-stack acquisiti al suo punto di origine34. Questo produce immagini finali ad alta risoluzione per l'analisi delle immagini. Se possibile, sarebbe meglio confrontare empiricamente diverse modalità di imaging per determinare il sistema migliore per il tuo esperimento28.

Ci sono molte possibili estensioni e applicazioni di smFISH. Nel nostro esperimento modello, abbiamo completato un ciclo di ibridazione con un set di sonde per il gene GREB1. Tuttavia, è possibile completare diversi cicli di smFISH in modo sequenziale (seqFISH)13,35. In questo metodo, gli mRNA nella cellula sono etichettati da cicli sequenziali di ibridazione, imaging, stripping della sonda e riibridizzazione. Al fine di aumentare in modo massiccio il multiplexing fino al livello dell'intero trascrittoma, sono state sviluppate tecniche di codifica a barre (ad esempio, MER-FISH)36,37,38. Questo utilizza una strategia di codice a barre a fluorescenza per identificare in modo univoco ogni mRNA37,39. Queste tecniche sono state adattate ai tessuti e, se accoppiate con la microscopia ad espansione, un metodo che espande fisicamente un campione con una rete polimerica, può fornire un maggiore accesso delle sonde agli RNA endogeni36,40,41. MER-FISH consente inoltre di aumentare la luminosità del segnale delle singole molecole mediante tecniche di amplificazione del segnale38. Il protocollo che abbiamo descritto è un processo di due giorni, tuttavia, è possibile abbreviare il protocollo smFISH in modo che l'ibridazione delle sonde all'RNA bersaglio possa avvenire in appena ~ 5 minuti (Turbo-FISH)26. L'immunofluorescenza può essere combinata con smFISH (IF-FISH) per rilevare contemporaneamente proteine e mRNA in un singolo campione42. Il protocollo deve essere ottimizzato per le sonde FISH e gli anticorpi utilizzati per ogni esperimento per ridurre la degradazione delle proteine e/o dell'RNA nel campione, in quanto alcuni materiali (cioè tamponi e fissativi) non sono compatibili sia per la lavorazione delle proteine che dell'mRNA43. Fare riferimento a diverse pubblicazioni del nostro laboratorio come esempi di esperimenti IF-FISH di successo oltre ai protocolli IF-FISH ottimizzati7,18.

In conclusione, presentiamo un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza a singola molecola (smFISH) che fornisce informazioni sull'eterogeneità delle singole cellule e sulla variazione allele per allele in risposta allo stimolo. Mentre questo protocollo è ottimizzato per il sistema modello precedentemente descritto, forniamo una serie di possibili aggiustamenti che possono migliorare altri modelli di geni bersaglio7.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

MAM, FS e MGM sono finanziati da NIEHS (Progetto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS sono supportati dal GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719), finanziato dal CPRIT. L'imaging è anche supportato dall'Integrated Microscopy Core presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti da NIH (DK56338 e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

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Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola
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Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

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